第七章植物基因工程

1、 第七章第七章 植物基因工程植物基因工程轉(zhuǎn)基因植物 世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，1983年得以培植出來。 轉(zhuǎn)基因番茄轉(zhuǎn)基因番茄 1994年，美國研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉(zhuǎn)基因番茄，以滿足人們的需求。 轉(zhuǎn)基因甜椒轉(zhuǎn)基因甜椒 甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學(xué)工作者，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。 轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)基因油菜 油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40左右。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好。 玉米是主要糧食之一，又可以提煉油

2、脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉(zhuǎn)基因玉米，品質(zhì)更好，產(chǎn)量更高。轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)基因玉米 轉(zhuǎn)基因牽?；ㄞD(zhuǎn)基因牽牛花 我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛花的花色，使矮牽?；ǖ幕ㄉ迂S富多彩。 轉(zhuǎn)基因小麥轉(zhuǎn)基因小麥 從植物體中分離出從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來的面粉，更適合用來來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)價(jià)值高

3、。的營養(yǎng)價(jià)值高。 本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：l 第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀l 第二節(jié)第二節(jié) 植物基因工程方法植物基因工程方法l 第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選l 第四節(jié)第四節(jié) 轉(zhuǎn)化體的鑒定與證明轉(zhuǎn)化體的鑒定與證明l 第五節(jié)第五節(jié) 植物基因工程研究的應(yīng)用和展望植物基因工程研究的應(yīng)用和展望l 植物基因工程的概念植物基因工程的概念 植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作，植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌傳轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒介導(dǎo)質(zhì)

4、粒介導(dǎo) 法、基因槍法、法、基因槍法、原生質(zhì)體介導(dǎo)法等），以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)原生質(zhì)體介導(dǎo)法等），以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀l 轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用前景和理論意義轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用前景和理論意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物或園藝作物中，改變它們通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物或園藝作物中，改變它們的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害、

5、獲得抗除草劑的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害、獲得抗除草劑的特性、改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、改的特性、改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、改變花的形狀和顏色、改變植物的育性和不親合性以及變花的形狀和顏色、改變植物的育性和不親合性以及改變植物的抗逆性等。改變植物的抗逆性等。轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋白和轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物或者生產(chǎn)某些有機(jī)化合物。植物次生代謝產(chǎn)物或者生產(chǎn)某些有機(jī)化合物。轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育中的作用提供了強(qiáng)有力的工具。中的作用提供了強(qiáng)有力的工具

6、。l 國際轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀國際轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀 從從19961996年到年到20042004年間，全球轉(zhuǎn)基因植物的生年間，全球轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和利用超出了當(dāng)初預(yù)料，基因作物種植面積增產(chǎn)和利用超出了當(dāng)初預(yù)料，基因作物種植面積增長了近長了近4848倍，從倍，從19961996年的年的170170萬公頃增加到萬公頃增加到20042004年的年的81008100萬公頃。萬公頃。l 國內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀國內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀 在某些領(lǐng)域達(dá)到了國際先進(jìn)水平。在某些領(lǐng)域達(dá)到了國際先進(jìn)水平。20042004年全年全國轉(zhuǎn)基因作物種植面積為國轉(zhuǎn)基因作物種植面積為370370萬公頃，成為繼萬公頃，成為繼美國、

7、阿根廷、加拿大、巴西之后的轉(zhuǎn)基因植美國、阿根廷、加拿大、巴西之后的轉(zhuǎn)基因植物種植第五大國。物種植第五大國。第二節(jié)第二節(jié) 植物基因工程方法植物基因工程方法 l原生質(zhì)體介導(dǎo)法l基因槍法l根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 一、原生質(zhì)體介導(dǎo)法一、原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)或概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)或 物理手段將外源直接導(dǎo)入植物細(xì)胞物理手段將外源直接導(dǎo)入植物細(xì)胞 的方法。的方法。主要方法主要方法: :l PEG PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化l 脂質(zhì)體（脂質(zhì)體（liposome)liposome)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 l 電激法電激法 l 激光導(dǎo)入法激光導(dǎo)入法l

8、顯微注射法顯微注射法l PEGPEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（PEGPEG）聚）聚 烯醇烯醇( (細(xì)胞促融劑細(xì)胞促融劑) )等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNADNA分子，分子， 進(jìn)入原生質(zhì)體的外源進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNADNA分子就有分子就有可能通過某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)可能通過某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程?；^程。 如：轉(zhuǎn)基因煙草如：轉(zhuǎn)基因煙草l 脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 原理：利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源原理：利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源DNADNA成球體成球體, , 通過植

9、物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包 含外源含外源DNADNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高; ; 操作繁瑣操作繁瑣; ; 技術(shù)性高。技術(shù)性高。 l 電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔電激穿孔“，形成可逆的瞬間通道，形成可逆的瞬間通道, ,從而促進(jìn)從而促進(jìn)外源外源DNADNA進(jìn)入原生質(zhì)體。進(jìn)入原生質(zhì)體。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化率高； 操作簡便操作簡便 ； 容易造成原生質(zhì)體損傷。容易造成原生質(zhì)體損傷。l 顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)

10、化顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用顯微注射儀將外源原理：利用顯微注射儀將外源DNADNA直接注入受體的細(xì)直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；方法簡單、轉(zhuǎn)化率高； 純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性；純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性； 對(duì)受體細(xì)胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育；對(duì)受體細(xì)胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育； 培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。 l 激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦成微米級(jí)的微束原理：將激光引入光學(xué)顯微鏡

11、聚焦成微米級(jí)的微束 照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNADNA流入細(xì)胞，流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 操作簡便；操作簡便； 工作效率高；工作效率高； 無宿主限制，適應(yīng)于各種動(dòng)植物；無宿主限制，適應(yīng)于各種動(dòng)植物； 對(duì)受體細(xì)胞生命活動(dòng)影響??；對(duì)受體細(xì)胞生命活動(dòng)影響?。?受體的類型廣泛；受體的類型廣泛； 用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化二、二、 基因槍法（微彈轟擊法）基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：將外源工作原理：將外源DNADNA包被在微小的金?；蜴u粒包被

12、在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNADNA進(jìn)入細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化?；虻霓D(zhuǎn)化。動(dòng)力類型：動(dòng)力類型： 火藥爆炸力；火藥爆炸力； 高壓氣體；高壓氣體； 高壓放電高壓放電 操作步驟操作步驟 （1 1）制備）制備DNADNA微彈；微彈； （2 2）準(zhǔn)備靶外植體材料；）準(zhǔn)備靶外植體材料； （3 3） DNADNA微彈轟擊；微彈轟擊； （4 4） 培養(yǎng)轟擊后的外植體培養(yǎng)轟擊后的外植體轉(zhuǎn)化率影響

13、因素轉(zhuǎn)化率影響因素 l 金屬微粒金屬微粒 金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良, ,但但是價(jià)格昂貴是價(jià)格昂貴. .l DNA DNA沉淀輔助劑沉淀輔助劑 這些化合物對(duì)這些化合物對(duì)DNADNA在微粒上的黏附有重要作用在微粒上的黏附有重要作用, ,但對(duì)植物受但對(duì)植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害. .l DNA DNA純度及濃度純度及濃度 l 微彈速度微彈速度l 植物材料內(nèi)在因素植物材料內(nèi)在因素 三、根癌桿菌介導(dǎo)法三、根癌桿菌介導(dǎo)法 根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成的根瘤中冠癭堿的根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植

14、物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚堿型章魚堿型、胭脂堿型胭脂堿型和和農(nóng)桿堿型農(nóng)桿堿型3 3種類型。在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的種類型。在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒，簡稱致瘤質(zhì)粒，簡稱TiTi質(zhì)粒。質(zhì)粒。 TiTi質(zhì)粒的改造策略質(zhì)粒的改造策略 TiTi質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型生型TiTi質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體存在著學(xué)質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體存在著學(xué)多障礙：多障礙： （1 1） 質(zhì)粒過大，操作困難質(zhì)粒過大，操作困難 （2 2）大型的）大型的TiTi質(zhì)粒有多個(gè)酶切位點(diǎn)質(zhì)粒有多個(gè)酶切位點(diǎn) （3 3）植

15、物激素類的影響）植物激素類的影響 （4 4） TiTi質(zhì)粒中存在不起作用的序列質(zhì)粒中存在不起作用的序列 （5 5） TiTi質(zhì)粒的局限性質(zhì)粒的局限性為了使為了使TiTi質(zhì)粒變成操作簡便、轉(zhuǎn)化有效的外源基質(zhì)粒變成操作簡便、轉(zhuǎn)化有效的外源基因轉(zhuǎn)移載體因轉(zhuǎn)移載體, ,必須對(duì)野生型的必須對(duì)野生型的TiTi質(zhì)粒進(jìn)行改造質(zhì)粒進(jìn)行改造. .植植物轉(zhuǎn)基因有一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng)物轉(zhuǎn)基因有一元載體系統(tǒng)和二元載體系統(tǒng), ,所以采所以采取不同的改造策略取不同的改造策略. .二元載體較一元載體的優(yōu)點(diǎn)二元載體較一元載體的優(yōu)點(diǎn): : 構(gòu)建比較方便構(gòu)建比較方便; ; 二元載體不會(huì)帶入大量的無用的多余的二元載體不會(huì)帶入大

16、量的無用的多余的DNADNA序列序列. .因?yàn)橐辉d體的因?yàn)橐辉d體的T-DNAT-DNA區(qū)中含中間載體區(qū)中含中間載體, ,他們會(huì)隨同外源基因一起被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中他們會(huì)隨同外源基因一起被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中. .根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理機(jī)理 六個(gè)步驟：個(gè)步驟：（1 1）農(nóng)桿菌對(duì)受體）農(nóng)桿菌對(duì)受體（2 2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞（3 3）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)（4 4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配（5 5）T-DNAT-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)（6 6）T-D

17、NAT-DNA的整合的整合基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的比基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的比較較 基因槍法多拷貝整合概率高，外源基因易沉默表達(dá)?；驑尫ǘ嗫截愓细怕矢?，外源基因易沉默表達(dá)。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率較高。較高。 基因槍法純物理轉(zhuǎn)化，不存在物種的限制?；驑尫兾锢磙D(zhuǎn)化，不存在物種的限制。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)存在宿主范圍的局限性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)存在宿主范圍的局限性。 基因槍法適于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研基因槍法適于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研 究。究。第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選 當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外

18、植體后，通常外當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化，只有植體中僅僅只有幾個(gè)少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化，只有采取有效的篩選方法，才能高效準(zhǔn)確的篩選到采取有效的篩選方法，才能高效準(zhǔn)確的篩選到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選使用。細(xì)胞篩選使用。 轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種：轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種：一、根據(jù)選擇基因的特點(diǎn)在篩選選擇培養(yǎng)基中一、根據(jù)選擇基因的特點(diǎn)在篩選選擇培養(yǎng)基中加入能抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)（如抗加入能抑制非轉(zhuǎn)化

19、細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)（如抗生素、除草劑等），生素、除草劑等），選擇基因通常為一種解毒選擇基因通常為一種解毒基因基因，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生長繁殖；的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生長繁殖；二、二、受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，在選擇性培，在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖，而選擇培養(yǎng)基可以補(bǔ)償這種養(yǎng)基中不能生殖，而選擇培養(yǎng)基可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。一、植物基因工程中的選擇基因一、植物基因工程中的選擇基因 植物基因工程中的基因主要是一類

20、編碼可使植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（有新霉素抗性基因（neoneor r）、慶大霉素抗性基）、慶大霉素抗性基因（因（gentgentr r）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTPHTP）基）基因（因（hpthpt）, ,以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（barbar）等。）等。1 1、新霉素抗性基因（、新霉素抗性基因（neoneor r） 新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5Tn5中分中分離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素

21、、新離的，其對(duì)應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和霉素和G418G418?？敲顾亍⑿旅顾乜赏ㄟ^與核卡那霉素、新霉素可通過與核糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成，G418G418可可通過抑制通過抑制80S80S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。的蛋白質(zhì)合成。新霉素抗性基因可使選擇試劑新霉素抗性基因可使選擇試劑磷酸化而失效。磷酸化而失效。2. 2. 慶大霉素抗性基因（慶大霉素抗性基因（gent gent r r） 該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因，它通過對(duì)慶大霉素的乙?；蛊涫Щ?。因

22、，它通過對(duì)慶大霉素的乙酰化而使其失活。 該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。煙草和番茄。 3.3.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTPHTP）基因）基因（hpthpt） 潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對(duì)許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過對(duì)潮霉有很強(qiáng)的毒性。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可通過對(duì)潮霉素磷酸化而使其失活。素磷酸化而使其失活。4.4.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（barbar） 該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其該基因是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因，其對(duì)應(yīng)的選

23、擇試劑為膦絲菌素（對(duì)應(yīng)的選擇試劑為膦絲菌素（bastabasta）, ,膦絲菌膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積?；?xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。二、報(bào)告基因二、報(bào)告基因 報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定快速測定、常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)胞，是常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)胞，是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。它應(yīng)用不依它應(yīng)用不依賴于外界選擇壓力的存在賴于外界選擇壓力的存在，這一點(diǎn)也是它與選擇，這一點(diǎn)也是它與選擇基因的區(qū)別之處?；虻膮^(qū)別之

24、處。 將報(bào)道基因與表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列相連，并將報(bào)道基因與表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列相連，并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，然后檢測細(xì)胞內(nèi)報(bào)道蛋白的含量轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，然后檢測細(xì)胞內(nèi)報(bào)道蛋白的含量或活性，即報(bào)道基因技術(shù)。或活性，即報(bào)道基因技術(shù)。 可在基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控、受體特性、藥物篩可在基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控、受體特性、藥物篩選和基因?qū)胂到y(tǒng)等研究中可廣泛應(yīng)用。選和基因?qū)胂到y(tǒng)等研究中可廣泛應(yīng)用。 理想報(bào)告基因的基本要求：理想報(bào)告基因的基本要求：1 1、受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性。、受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性。2 2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞。、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞。3

25、 3、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測特性。檢測特性。目前最常用的報(bào)告基因有：目前最常用的報(bào)告基因有： - -葡萄糖苷酸酶基葡萄糖苷酸酶基因（因（gusgus）; ;氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；熒光素酶基氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；熒光素酶基因因; ;分泌型堿性磷酸酶分泌型堿性磷酸酶 ; ;熒光蛋白家族熒光蛋白家族 - -葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（gusgus） gusgus基因編碼基因編碼 - -葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶, ,存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，該酶是一種水解酶，能催化許多該酶是一種水解酶，能催化許多 - -葡萄糖苷酸類物質(zhì)

26、的葡萄糖苷酸類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的水解。絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUSGUS活性，活性，許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源GUSGUS活性，因而活性，因而gusgus基因基因被廣泛應(yīng)用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，尤被廣泛應(yīng)用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，尤其是在研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，其是在研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，gusgus基因基因應(yīng)用最多。應(yīng)用最多。 其最大優(yōu)勢是易于用組化法觀測其原位表達(dá)，是最常用其最大優(yōu)勢是易于用組化法觀測其原位表達(dá)，是最常用的監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率的報(bào)道基因之一。的監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率的報(bào)道基因之一。氯霉素

27、乙酰轉(zhuǎn)移酶基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9Tn9，它能夠催化，它能夠催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙?；饔?，從而使其失導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙酰化作用，從而使其失去活性。真核細(xì)胞中部含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶去活性。真核細(xì)胞中部含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源活性，因而該基因可作為基因，無該酶的內(nèi)源活性，因而該基因可作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇基因及報(bào)告基因。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇基因及報(bào)告基因。 CAT在哺乳細(xì)胞無內(nèi)源性表達(dá)，性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期相對(duì)較短，適于檢測其瞬時(shí)適于檢測其瞬時(shí)表達(dá)

28、。表達(dá)。 可用同位素標(biāo)記法、熒光法和自動(dòng)ELISA法檢測其活性，也可進(jìn)行Western blots和免疫組織化學(xué)分析。CAT與其它報(bào)道基因相比，線性范圍較窄，靈敏性較低。熒光素酶熒光素酶 熒光素酶是能夠催化不同底物熒光素酶是能夠催化不同底物( (熒光素、熒光素、COCOelenterazineelenterazine) )氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細(xì)胞無內(nèi)源氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細(xì)胞無內(nèi)源性熒光素酶。性熒光素酶。 最常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶最常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和和ReniHaReniHa熒光素酶（熒光素酶（海洋腔腸海洋腔腸LucLuc ）。）。 細(xì)菌熒

29、光素酶對(duì)熱敏感，因此其在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用受細(xì)菌熒光素酶對(duì)熱敏感，因此其在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用受到限制。到限制。 螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性范圍寬達(dá)螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性范圍寬達(dá)7-87-8個(gè)個(gè)數(shù)量級(jí)，數(shù)量級(jí)，是最常用于哺乳細(xì)胞的報(bào)道基因是最常用于哺乳細(xì)胞的報(bào)道基因。 用熒光比色計(jì)即可檢測酶活性，因而適于高通量篩選。用熒光比色計(jì)即可檢測酶活性，因而適于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應(yīng)用，無需裂解細(xì)胞即可檢測酶活性；應(yīng)用，無需裂解細(xì)胞即可檢測酶活性； ReniHaReniHa熒光素酶催化熒光素酶催化COCOelent

30、erazineelenterazine氧化，產(chǎn)氧化，產(chǎn)物可透過生物膜，可能是最適用于活細(xì)胞的報(bào)道分子物可透過生物膜，可能是最適用于活細(xì)胞的報(bào)道分子 。熒光素酶基因熒光素酶基因 該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光。該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光。熒光素是熒光素酶催化的底物合成，不同熒光素?zé)晒馑厥菬晒馑孛复呋牡孜锖铣?，不同熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定差異甚至完全不同。熒光素酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定差異甚至完全不同。熒光素酶基因的活性檢測非常簡單，直接將被檢的材料進(jìn)基因的活性檢測非常簡單，直接將被檢的材料進(jìn)入加有熒光素和入加有熒光素和ATPATP的緩沖液中，置于暗室用肉的緩沖液中，置于暗室用肉

31、眼直接觀察熒光，或眼直接觀察熒光，或覆蓋覆蓋X-X-光光膠片曝光，也也用膠片曝光，也也用熒光光度計(jì)定量熒光光度計(jì)定量檢測檢測. .熒光蛋白家族 熒光蛋白家族是從水螅綱和珊瑚類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的分熒光蛋白家族是從水螅綱和珊瑚類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的分子量為子量為202030kD30kD的同源性蛋白。的同源性蛋白。 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白(GFP)(GFP)是應(yīng)用最多的發(fā)光蛋白。是應(yīng)用最多的發(fā)光蛋白。 GFPGFP存在于發(fā)光水母存在于發(fā)光水母(Aequorea(Aequorea Victoria) Victoria)。 用用395nm395nm的的UVUV和和475nm 475nm 的藍(lán)光激發(fā)，的藍(lán)光激發(fā)，GF

32、PGFP可在可在508nm508nm處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物。處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物。 GFPGFP最大的優(yōu)勢是無需損傷細(xì)胞即可研究細(xì)胞內(nèi)事件。最大的優(yōu)勢是無需損傷細(xì)胞即可研究細(xì)胞內(nèi)事件。 19911991年克隆了年克隆了GFPGFP基因，目前已獲得幾個(gè)突變體。如基因，目前已獲得幾個(gè)突變體。如“紅色遷移紅色遷移”突變體突變體(“red(“redshift”mutantshift”mutant) )，其熒光，其熒光更強(qiáng)。其突變體還有藍(lán)色熒光蛋白更強(qiáng)。其突變體還有藍(lán)色熒光蛋白(BFP)(BFP)、增強(qiáng)型、增強(qiáng)型GFP(enhancedGFP(enhanced GFP)

33、 GFP)和去穩(wěn)定和去穩(wěn)定EGFP(destabilizedEGFP(destabilized EGFP) EGFP)等。紅色熒光蛋白等。紅色熒光蛋白(RFP)(RFP)是從珊瑚是從珊瑚(Dcosoma(Dcosoma sp sp) )中分離的發(fā)光蛋白中分離的發(fā)光蛋白(drFP583(drFP583或或DsRedDsRed) )可發(fā)射明亮的紅色熒光?？砂l(fā)射明亮的紅色熒光。 這些常用的報(bào)道基因也可被聯(lián)合應(yīng)用，可同時(shí)檢測2個(gè)甚至3個(gè)基因的表達(dá)。報(bào)道基因的選擇依賴于其靈敏性、可靠性及監(jiān)測的動(dòng)力學(xué)范圍。穩(wěn)定性好的報(bào)道基因適于基因轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)研究和高通量篩選，尤其適用于基因轉(zhuǎn)移的定性研究。報(bào)道基因 隨著技

34、術(shù)和檢測方法的進(jìn)步，熒光分析以其能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的活性可視化和對(duì)細(xì)胞的非破壞性而越來越成為主流，因此熒光素酶和綠色熒光蛋白熒光素酶和綠色熒光蛋白這兩種可發(fā)出熒光的報(bào)告基因成為眾多報(bào)告基因中的后起之秀. 綠色熒光蛋白(GFP) 1992年，Prasher和Chaltqe報(bào)道了幾種生物發(fā)光水母的發(fā)光是由于能量轉(zhuǎn)移至GFP所致，該蛋白在接受了Ca2+激活的光蛋白水母素的能量后可在體內(nèi)產(chǎn)生熒光，這一過程不需要底物或輔助因子。GFP是一條由238個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，純化的GFP與體內(nèi)表達(dá)的該蛋白有相似的發(fā)光譜，無論在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)用藍(lán)光或紫外光激發(fā)下，都能產(chǎn)生一種很亮的綠色熒光。鑒于上述

35、特性以及所具有的低毒性、不干擾正常的細(xì)胞活動(dòng)等優(yōu)點(diǎn)，從此開辟了GFP在生物領(lǐng)域中(尤其是體內(nèi)分析)的廣泛應(yīng)用，目前已應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域、基因表達(dá)的蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞定位以及藥物的篩選等諸多方面。 為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體. .我們采用我們采用PCRPCR技術(shù)技術(shù) . Southern. Southern雜交技術(shù)雜交技術(shù). . 為了驗(yàn)證外源基因是否表達(dá)為了驗(yàn)證外源基因是否表達(dá). .我們采用我們采用RT-PCRRT-PCR技術(shù)、技術(shù)、NorthernNorthern雜交技術(shù)、雜交技術(shù)、WesternWestern雜交技雜交技術(shù)術(shù). .第四節(jié)第四節(jié) 轉(zhuǎn)化體的鑒

36、定和證實(shí)轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí) PCRPCR檢驗(yàn)外源基因的整和檢驗(yàn)外源基因的整和在轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測中在轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測中, ,通過設(shè)計(jì)外源基因兩端通過設(shè)計(jì)外源基因兩端的特異引物的特異引物, ,采用采用PCRPCR可以使外源基因得到大量可以使外源基因得到大量擴(kuò)增擴(kuò)增, ,然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴(kuò)增帶然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴(kuò)增帶的有無的有無, ,從而判斷外源基因是否整合到受體植物從而判斷外源基因是否整合到受體植物的基因組的基因組. .優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) : :由于對(duì)模板由于對(duì)模板DNADNA的要求少的要求少, ,適合與轉(zhuǎn)基因適合與轉(zhuǎn)基因體的早期檢測體的早期檢測. .缺點(diǎn)缺點(diǎn): :容易受到外界因素

37、的干擾容易受到外界因素的干擾. . SouthernSouthern雜交檢測外源基因的整合雜交檢測外源基因的整合原理原理: :來源不同但具有互補(bǔ)序列的兩條多核苷來源不同但具有互補(bǔ)序列的兩條多核苷酸鏈通過堿基配對(duì)原則形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)酸鏈通過堿基配對(duì)原則形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu). .其中其中一條被標(biāo)記成為探針一條被標(biāo)記成為探針, ,探針與互補(bǔ)的核苷酸序探針與互補(bǔ)的核苷酸序列雜交列雜交, ,通過放射自顯影技術(shù)可以被檢測出來通過放射自顯影技術(shù)可以被檢測出來. .雜交方式雜交方式: :SouthernSouthern斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交 SouthernSouthern印記雜交印記雜交( (最常用最常用) ) Sout

38、hern Southern原位雜交原位雜交RT-PCRRT-PCR 雜交檢測外源基因的整合雜交檢測外源基因的整合適用范圍適用范圍: :外源基因在受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄的初外源基因在受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄的初步檢測步檢測. .原理原理: :以轉(zhuǎn)基因個(gè)體總以轉(zhuǎn)基因個(gè)體總RNARNA或或mRNAmRNA為模板為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, ,然后然后PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增, ,如果可以獲得特意如果可以獲得特意的的cRNAcRNA擴(kuò)增條帶擴(kuò)增條帶, ,則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄錄. .優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :簡單簡單 快速快速 對(duì)對(duì)mRNAmRNA抽提的數(shù)量和質(zhì)量抽提的數(shù)量和質(zhì)量都要求不高都要求不高. . NorthernNorthern雜交檢測外源基因的表達(dá)雜交檢測外源基因的表達(dá) 與與Southern Southern 的不同是的不同是: : 固體膜上轉(zhuǎn)移固定的固體膜上轉(zhuǎn)移固定的是是 總總RNARNA或或mRNA.mRNA.探針與膜上探針與膜上RNARNA形成形成RNA-DNARNA-DNA雜交雙鏈雜交雙鏈. .通過放射自顯影的強(qiáng)度可通過放射自顯影的強(qiáng)度可以判斷