蛋白質(zhì)的表達(dá)分離純化實(shí)驗(yàn)

1、蛋白質(zhì)的表達(dá)、別離、純化實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)表達(dá)、別離、純化可以：1探索和研究基因的功能以及 基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理； 2供作結(jié)構(gòu)與功能的研究； 3作為催化 劑、營(yíng)養(yǎng)劑等。實(shí)驗(yàn)方法原理攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌 BL21中，在37 C,PTG 誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有 6 個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移 酶蛋白，該蛋白可用一種通過(guò)共價(jià)偶連的次氨基三乙酸NTA使鎳 離子 Ni2+ 固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析MCAC。蛋白質(zhì)的純化程度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)材料： 大腸桿菌 BL21試劑、試劑盒：LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素、Washing Buffer Eluti

2、on Buffer IPTG 、蒸餾水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化鈉儀器、 耗材：搖床 、離心機(jī)、 層析柱、 離心管、 移液槍、 槍 頭盒 、燒杯 、玻璃棒實(shí)驗(yàn)步驟一、試劑準(zhǔn)備1. LB 液體培養(yǎng)基： Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ， NaCl 10 g ，用蒸餾水配至 1000 mL 。2. 氨芐青霉素： 100 mg/mL 。3. 上樣緩沖液： 100 mM NaH2PO4 ，10 mM Tris ，8M Urea ， 10 mM 2-ME ， pH8.0 。4. Washing Buffer ： 100 mM NaH2PO4 ， 10 mM Tris

3、 ， 8 M Urea ， pH6.3 。5. Elution Buffer ：100 mM NaH2PO4 ， 10 mMTris ，8M Urea ， 500 mM Imidazole ， pH8.0 。6. IPTG: 100mM IPTG 異丙基硫代-伕D-半乳糖苷：2.38g IPTG溶于1OOml ddH20 中,0.22 g濾膜抽濾，-20 C保存。二、獲得目的基因1. 通過(guò) PCR 方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板， 按基因序 列設(shè)計(jì)一對(duì)引物在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn) ， PCR 循環(huán)獲得所需基因片段。2. 通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取

4、總 RNA , 以 mRNA 為模板， 逆轉(zhuǎn)錄形成 cDNA 第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板 進(jìn)行 PCR 循環(huán)獲得產(chǎn)物。三、構(gòu)建重組表達(dá)載體1. 載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶 同引物的酶切位點(diǎn) 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收 Kit 或凍融法回收 載體大片段。2. PCR 產(chǎn)物雙酶切后回收，在 T4DNA 連接酶作用下連接入載 體。四、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a,根據(jù)重組載體的標(biāo)志抗Amp 或藍(lán)白斑作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶 切初步鑒定。2. 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否那么應(yīng)篩選更多克

5、隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。3. 以此重組質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞五、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)1. 接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌 株于5 mL LB液體培養(yǎng)基中含100 ug/mL 氨芐青霉素，37 C震 蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2. 按1 : 50或1 : 100的比例稀釋過(guò)夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過(guò) 夜培養(yǎng)物于100 mL 含100 ug/mL 氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中， 37 C震蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0.6 - 0.8 最好0.6，大約需3 h。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。3. 對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組參加IPT

6、G至終濃度0.5 mmol/l37 C繼續(xù)培養(yǎng)1-3h。4. 12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20 C 或-70 C冰箱中。六、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的別離、純化1. NTA 層析柱的準(zhǔn)備： 在層析柱中參加 1 mL NTA 介質(zhì)，并分 別用 8 mL 去離子水， 8 mL 上樣緩沖液洗滌。2. 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，參加 5 mL 上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔 的混勻樣品60 min , 4C 12000 rpm 離心30 min ,將上清吸至一 個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SD

7、S-PAGE 分 析。3. 上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出 液，取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。4. 洗脫雜蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱， 直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脫液，約 3-4 h ，取 10 ul 洗脫開(kāi)始 時(shí)的樣品用于 SDS-PAGE 分析。5. 洗脫目標(biāo)蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 級(jí)分， 分別取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析?？记绊氈?. 選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為 方便純化，可選擇

8、融合表達(dá)； 如為獲得天然蛋白， 可選擇非融合表達(dá)。2. 融合表達(dá)時(shí)在選擇外源 DNA 同載體分子連接反響時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn) 錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。3. 菌液 OD 值要小于 1 ，否那么細(xì)胞太濃太老，不易破碎，且質(zhì)粒易 喪失。4. 誘導(dǎo)時(shí)間最好做一個(gè)梯度，不同蛋白誘導(dǎo)時(shí)間需摸索5. 誘導(dǎo)溫度適當(dāng)摸索：25、30 C6. IPTG 濃度：一般在 1 mM 以內(nèi)，可適當(dāng)摸索7. 超聲條件可視實(shí)際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液 清亮不粘稠。其他一、原核表達(dá)1. 原核表達(dá)簡(jiǎn)介將克隆化基因插入適宜載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的 方法一般稱為原核表達(dá)。 這種方法在蛋白純化、 定

9、位及功能分析等方 面都有應(yīng)用。2. 大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白的特點(diǎn)1易于生長(zhǎng)和控制；2用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；3有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？?供選擇； 4 在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻 譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。3. 原核表達(dá)載體 通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：1選擇標(biāo)志的編碼序列；2可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子； 3轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列 轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn) ；4一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭； 5宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。4. 原核表達(dá)一般程序獲得目的基因準(zhǔn)備表達(dá)載體將目的基因插入表達(dá)載體中

10、序驗(yàn)證轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)表達(dá)蛋白的分析擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)。Word是學(xué)生和職場(chǎng)人士最常用的一款辦公軟件之一，99.99% 的人知道它，但其實(shí)，這個(gè)軟件背后，還有一大批隱藏技能你不知道。掌握他們，你將開(kāi)啟新世界的大門。Tab+Enter,在編過(guò)號(hào)以后，會(huì)自動(dòng)編號(hào)段落Ctrl + D 調(diào)出字體欄，配合 Tab+Enter 全鍵盤操作吧Ctrl + L 左對(duì)齊， Ctrl + R 右對(duì)齊， Ctrl + E 居中Ctrl + F 查找，Ctrl + H 替換。然后關(guān)于替換，里面又大有學(xué)問(wèn)！有時(shí)候Word文檔中有許多多余的空行需要?jiǎng)h除，這個(gè)時(shí)候我們可以完全可以用查找替換來(lái)輕松解決。翻開(kāi) 編輯菜單中的 替換對(duì)話框，把光標(biāo)定位在 查找內(nèi)容輸入框中，單擊 高級(jí)按鈕，選擇 特