骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法

1、2.5.4 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法2.5.4.1 不脫鈣骨骨標(biāo)本的包埋（1）包埋前單體（甲基丙烯酸甲酯）的洗脫方法 將 1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗（2L）中。 加入5% NaOH溶液500ml，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄去。 重復(fù)操作“2” 三次，三次的總量與單體量相當(dāng)（洗脫阻滯劑）。 加入500ml蒸餾水，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄去。 重復(fù)操作“2” 三次，三次的總量與單體量相當(dāng)（洗脫NaOH）。 將上述處理過的單體放入無水CaCl2（1000 ml：500g）脫水2次。 濾紙過濾，收集濾液。 -20保存?zhèn)溆?，第二天取出看有無冰晶漂浮：無

2、，表明無水可備用；有，則需重新脫水。（2）脛骨上段包埋前的制備過程 暴露骨髓腔將固定液中的脛骨用低速鋸鋸開，暴露骨髓腔，解剖部位如下： 脫水分別通過70%乙醇2天，95%乙醇2天，100%乙醇1天，100%乙醇1天，四個(gè)脫水過程，二甲苯透明1天。 滲透先后用浸液、浸液、浸液分別浸透2天。三種浸液的配制方法如下：浸液甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，磁力攪拌器上攪拌3小時(shí)。浸液甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化笨甲酰1.0g，磁力攪拌器上攪拌4小時(shí)。浸液甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化苯甲酰2.5g，磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)。（3）包埋

3、用新鮮配置的浸液（當(dāng)日配置）倒入裝有浸潤好的骨頭塊容積約為15 ml的小瓶中，倒入的包埋劑約，蓋好瓶蓋，并在瓶蓋上插一注射器針頭，室溫過夜。第二天把包埋瓶置入37-39的水育箱中聚合約48小時(shí)，直至包埋塊形成。若為脛骨中段骨，則需在包埋前幾天預(yù)先倒入少量包埋劑于小玻璃瓶中作包埋塊底襯，變硬后為1.5cm高為宜。包埋時(shí)將脛骨中段至于瓶中央，在倒入2cm高的包埋劑。若為脛骨上段，僅需將其鋸開面貼瓶底中央包埋，倒入約3.5cm高的包埋劑即可。2.5.4.2 不脫鈣股組織片的制備 （1）載玻片的制備 清洗把玻片在酸缸中浸泡24小時(shí)，取出，先用自來水沖洗，后用單蒸水沖洗，晾干。 上膠稱取1.8g明膠溶于

4、200ml的雙蒸水中，加熱溶解明膠（90度）稱取1g的硫酸鉻鉀溶于25ml的雙蒸水中，待其完全溶解后緩緩倒入沸騰的明膠溶液中，邊加邊攪拌，直至其完全溶解再停止加熱，溶液室溫冷卻至60左右即可使用；將載玻片浸入60的膠液中2min，取出晾干后即可使用。（2）切片 打磨 用石膏打磨機(jī)將包埋塊打磨成合適大小，并暴露切面，把切面打磨到合適位置。 切片將打磨好的塊固定在切片機(jī)上，右手慢慢切下。同時(shí)，左手用一沾有40%乙醇的軟毛刷輕輕地?fù)芟虑衅?，注意不要弄爛切下的片，然后用毛刷把片轉(zhuǎn)移到滴有一滴70%酒精的載玻片上，再滴一滴70%酒精，然后漫漫展平切片，蓋上一張薄塑料片，并用濾紙將多余的酒精吸干。一個(gè)標(biāo)本

5、切兩種厚度的片5m（薄片）和9m（厚片）：薄片用于Masson-Goldner Trichrome染色數(shù)破骨細(xì)胞；厚片可直接封片，測量動(dòng)態(tài)參數(shù)；或硝酸銀染色，測量靜態(tài)參數(shù)。 烤片將切好的一組片，用夾子夾穩(wěn)，放入40左右的鼓風(fēng)烤箱中烤4小時(shí)左右，取出備用。（3）骨片染色5m的薄片常采用Masson-Goldner Trichrome染色，染色后，骨質(zhì)為綠色，骨髓為紅色，用于觀察骨小梁表面的破骨細(xì)胞和測量其周長。9m的厚片可采用硝酸銀染色，染色后，骨質(zhì)為黑色，反映礦化后的骨質(zhì)，用于觀察骨量和骨結(jié)構(gòu)，下面是Masson-Goldner Trichrome染色過程。 工作液的準(zhǔn)備AWeigert he

6、matoxylin工作液：溶液A含Mematoxylin（蘇木素精）1g加入95%酒精100ml中過濾備用；溶液B含29%氯化鐵4ml、稀鹽酸1ml（用40%的鹽酸加蒸餾水1:4稀釋），然后加蒸餾水至100ml。將等份的溶液A和溶液B混合即得工作液。B. Poncean Fuchsin Stock工作液：配制溶液A含Poncean（麗春紅）1g加蒸餾水100 ml，溶液B含Acid Fuchsin（品紅）1g加蒸餾水100ml；將3份的溶液A和1份的溶液B混合配成原液，然后將原液用0.2%的醋酸按5:1的比例稀釋成工作液。C. Phosphotungstic acid-Orange G工作液：

7、將Orange G 2g和Phosphotungstic acid 4g加入100ml蒸餾水中，用前過濾。D. Light green工作液：將Light green（亮綠）0.2g和醋酸0.2ml加入100ml蒸餾水中，用前過濾。 染色過程脫塑劑2-Methyloxethyl acetate 25min 2次Weigerts hematoxylin工作液 25min蒸餾水漂洗自來水漂洗10min蒸餾水漂洗Poncean-Fuchsin工作液染色17min1%醋酸漂洗2次，每次1min新鮮過濾的Orange G液染色7min1%醋酸漂洗2次，每次1min新鮮過濾的Light green染色15

8、min-20min1%醋酸漂洗2次，每次1min95%酒精脫水1min無水酒精脫水2min，2 次二甲苯清洗2次，每次2min，樹脂封片（4）磨片制備磨片是將脛骨中段先用鋸片機(jī)鋸成100m厚的骨片，鋸骨時(shí)從脛腓韌帶聯(lián)合近側(cè)端以脛骨干下端與腓骨完全分離為有效骨片，可盡量減少切片所造成的誤差。共鋸三片，脛腓結(jié)合處為第一片，接下來依次為第二、三片。在磨砂玻璃上將第二片磨成40m的薄片，再進(jìn)行酒精梯度脫水：70%-70%-95%-95%-100%-100%，二甲苯透明后樹脂封片，測量皮質(zhì)骨的各項(xiàng)參數(shù)。2.5.4.3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測定（1）測量分析范圍 脛骨上段測量范圍：從生長板往下畫出0.5m

9、m，以避開初級(jí)海綿體，再從0.5mm處往下畫3mm。見圖2.5。皮質(zhì)骨測量范圍為橫斷面，見圖2.6 圖2.5 脛骨上段測量范圍 圖2.6 皮質(zhì)骨測量范圍Fig 2.5 Scope of PTM for bone histomorphometry Fig 2.6 Scope of MTM for measure （2）動(dòng)、靜態(tài)參數(shù)測量和計(jì)算本實(shí)驗(yàn)所有參數(shù)采用國際通用標(biāo)準(zhǔn)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)術(shù)語命名24-25。用半自動(dòng)圖象數(shù)字化儀直接測出參數(shù)的中英文名稱、符號(hào)及單位等如表2.3和表2.5所示。但這些參數(shù)還不能直接用于分析骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨形成和骨吸收等,要通過國際通用的公式21對(duì)直接測得的參數(shù)計(jì)算，才能

10、用于分析。計(jì)算參數(shù)的中英文名稱、符號(hào)及計(jì)算公式等如表2.4和表2.6所示。表2.3松質(zhì)骨測量參數(shù)Tab2.3 Measurement s of PTM cancellous bone 中文名稱英文名稱符號(hào)單位骨組織面積Tissue areaT.Armm2骨小梁面積Trabecular bone areaTb.Armm2骨小梁周長Trabecular perimeterTb.Pmmm單熒光周長Singlelabel perimetersL.Pmmm雙熒光周長Doublelabel perimeterdL.Pmmm雙熒光間距Interlabel widthIr.L.Wium破骨細(xì)胞數(shù)量osteoc

11、last numberN.Oc#破骨細(xì)胞周長ostelclast perimeterOc.Pmmm表2.4 松質(zhì)骨計(jì)算參數(shù)及計(jì)算公式Tab2.4 Calculations of PTM cancellous bone中文名稱符號(hào)單位公式骨小梁面積百分?jǐn)?shù)%Tb.Ar%Tb.Ar/T.Ar*100骨小梁寬度Tb.Wium(2000/1.199)(Tb.Ar/Tb.Pm)骨小梁數(shù)量Tb.N#/mm(1.199/2)*(Tb.Pm/T.Ar)骨小梁分離度Tb.Spum(2000/1.199)*(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm熒光周長百分?jǐn)?shù)%L.Pm%(dL.Pm±sL.Pm/2)/Tb.

12、pm*100骨礦化沉積率MARum/dIrL.Wi/intervel骨形成率BFR/BSum/d*100 （L.Pm±sL.Pm/2）*MAR/Tb.Pm*100BFR/BV%/year（dL.Pm±sL.Pm/2）*MAR/1000/Tb.Ar*365*100BFR/TV%/year（dL.Pm±sL.Pm/2）*MAR/1000/T.Ar*365*100單位骨小梁面積破骨細(xì)胞數(shù)Oc.N#/mmN.Oc/Tb.Ar破骨細(xì)胞周長百分率Oc.Pm%Oc.Pm/Tb.Pm*100 表2.5 松質(zhì)骨測量參數(shù)Tab2.5 Histomorphometric measure

13、ments of Tx cortical bone中文名稱英文名稱符號(hào)單位骨組織總面積Total tissue areaT.Armm2骨髓總面積Marrow areaMa.Armm2骨外膜面周長Periosteal perimeterP.Pmmm骨內(nèi)膜面周長EndBGPortical perimeterE.Pmmm骨外膜面單熒光周長Single label perimeterP.sL.Pmmm雙熒光周長Double label perimeterP.dL.Pmmm雙熒光間距Inter label widthP.Ir.L.Wium骨內(nèi)膜面單熒光周長Single label perimeterE.

14、sL.Pmmm雙熒光周長Double label perimeterE.dL.Pmmm雙熒光間距Inter label widthE.Ir.L.Wium骨吸收周長Eroded perimeterEr.Pmmm表2.6 皮質(zhì)骨計(jì)算參數(shù)及計(jì)算公式Tab2.6 Histomorphometric calculations of Tx cortical bone中文名稱符號(hào)單位公式皮質(zhì)面積Ct.Armm2Tb.Ar-Ma.Ar皮質(zhì)面積百分率%Ct.Ar%Ct.Ar/T.ar*100骨髓面積百分率%Ma.Ar%Ma.Ar/T.Ar*100骨外膜標(biāo)記周長百分率%P-L.Pm%(P-dL.Pm+P-sL.P

15、m/2)/P.Pm*100骨外膜骨礦化沉積率P-MARum/dP-Ir.L.Wi/Interval骨外膜骨形成率P-BFR/BSum/d*100P-L.Pm*P-MAR/P.Pm*100骨內(nèi)膜標(biāo)記周長百分率%E-L.Pm% (E-dL.Pm+E-sL.Pm/2)E.Pm*100骨內(nèi)膜骨礦化沉積濾E-MARum/dE-Ir.L.Wi/Interval骨內(nèi)膜骨形成率E-BFR/BSum/d*100E-L.Pm*E-MAR/E.Pm*100（3）參數(shù)的意義 靜態(tài)參數(shù)用來評(píng)價(jià)藥物防治效果，描述骨量多少和骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（%Tb.Ar ）指骨小梁面積占骨組織面積的百分率，反映骨量的多

16、少。從數(shù)學(xué)公式上推算，它等于骨小梁寬度與數(shù)量的乘積的1/10，也就是說，骨量多少由寬度和數(shù)量二者共同決定。骨小梁寬度（Tb.Th）用于描述骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)，解釋骨量變化。其變化可影響骨量，在數(shù)量一定的條件下，寬度越寬，骨量越多。骨小梁數(shù)量（Tb.N）用于描述骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)，解釋骨量變化。其變化可影響骨量，在寬度一定的條件下，數(shù)量越多，骨量越多。骨小梁分離度（Tb.Sp）指骨小梁之間的平均距離，用來描述骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)。分離度越大，骨小梁之間距離就越大，骨就越疏松。皮質(zhì)骨面積（Ct.Ar）反映皮質(zhì)骨骨量的多少，是中段骨組織橫截面與骨髓腔面積之差。皮質(zhì)骨面積百分?jǐn)?shù)（Ct.Ar%）反映皮質(zhì)骨在中段骨橫截

17、面總骨組織面積中所占比例。骨髓腔面積百分?jǐn)?shù)（%Ma.Ar）反映骨髓腔在中段骨橫截面總骨組織面積中所占比例。 動(dòng)態(tài)參數(shù)動(dòng)態(tài)參數(shù)包括骨形成參數(shù)和骨吸收參數(shù)，通過動(dòng)態(tài)參數(shù)，可以了解骨表面礦化的量和速率，并解釋靜態(tài)參數(shù)變化的原因。A. 骨形成參數(shù)熒光周長百分率（%L.Pm） 反映進(jìn)行礦化的骨周長占骨表面總周長的百分率，也反映成骨細(xì)胞的數(shù)量。礦化沉積率（MAR）指每天礦化的寬度。反映骨礦化的快慢，代表成骨細(xì)胞的活性。骨形成率（BFR/BS） %L.Pm與MAR的乘積，代表骨表面形成的活躍程度。骨形成率（BFR/BV）每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總面積的百分比，代表骨形成和骨轉(zhuǎn)換的活躍程度。此參數(shù)越高，表示骨轉(zhuǎn)換也越高，是反映轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要指標(biāo)。骨形成率（BFR/TV）每年新形成的骨小梁面積占骨組織面積的百分比，代表每年骨小梁表面新形成骨的總量。此參數(shù)與BFR/BS、BFR/BV不同，它受兩