醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文

1、醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文 色素上皮衍生因子（ PEDF ）在膀胱癌中的表 達(dá)及其對(duì)膀胱癌治療作用的研究一、趨勢(shì)判斷和需求分析國內(nèi)外現(xiàn)狀、 水平和發(fā)展趨勢(shì) （含知識(shí)產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)狀況） ；經(jīng)濟(jì)建 設(shè)和社會(huì)發(fā)展需求；科學(xué)技術(shù)價(jià)值、特色和創(chuàng)新點(diǎn)。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi) 統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率占全身腫瘤的第 8 位，在男性其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病 率 9.9/10 萬；在女性，其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為 2.3/10 萬，占第 25 位。死亡率在男性為 4.2/10萬，占全身腫瘤死亡率的 第 9 位，在女性為 1.1/10 萬，占第 16 位。在我國 , 膀胱 癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤， 占全身惡性腫瘤的 3.2%

2、，1995 年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為 7/10 萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為 8.6/10 萬人1 ，且今后發(fā)病 率仍有上升趨勢(shì)。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤， 膀胱癌發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究始終是臨床基礎(chǔ)研 究的重點(diǎn)之一。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱 灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措 施, 但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù) 發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá) 80%，其中大約 16%-25% 復(fù)發(fā)的腫瘤 其惡性程度增加， 有 10% 發(fā)展為浸潤(rùn)性或轉(zhuǎn)移性癌， 因 此,尋找一種新的、 更有效的生物治療方法， 是當(dāng)前臨床 迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方

3、法中，無論是化療還 是免疫治療，主要機(jī)制是通過直接殺死腫瘤細(xì)胞、阻斷 腫瘤細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的方式來抑制腫瘤生長(zhǎng)。 做為一種實(shí)體性腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的增殖固然重要， 而新生血管的形成在腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)、 轉(zhuǎn)移過程中也 發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng) 在血管生長(zhǎng)因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于 平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是發(fā)生惡性腫瘤時(shí)，這種 平衡向血管生成的方向發(fā)展。 當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到腫瘤組織 超過 2mm 時(shí)就會(huì)有新生血管形成，如果沒有新生血管 生成，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，甚至停止 2， 3?？寡?管生成療法是不同于目前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策 略，具有高效低毒和不易

4、產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn) 4 。有關(guān)血 管生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)抑制因子在腫瘤中所起作用， 以 及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究的 一個(gè)熱點(diǎn)。近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子( pigment epithelium derived factor, PEDF )是一種對(duì)腫瘤有抑制 作用的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子是 Tombran-Tink 等在 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的， 由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的一種蛋 白質(zhì)，分子量為 50 KD5 ，屬于 serpin 卵白蛋白/PAT-2 亞群，其基因全長(zhǎng) 16 kb ，位于染色體 17p13.1-pter 6 。 多項(xiàng)研究表明， PEDF 是一種天然的高效的新 生血管

5、抑制劑 7 ，并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化起到抑制腫 瘤生長(zhǎng)的作用。 Tombran-Tink 等將 PEDF 基因定位于 染色體 17p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切，提示該基 因可能是抑癌基因或腫瘤相關(guān)基因 5 。對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 編碼 PEDF 的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 ( Vascular endothelial growth factor ， VEGF )存在的 情況下， PEDF 明顯阻止了血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和遷 移。對(duì)患有 CNV/AMD 患者的體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)， PEDF 大量減少的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯遷移 ; 而對(duì)照組含 有正常水平 PEDF,則抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移6

6、。 Crawford 等發(fā)現(xiàn) PEDF 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是腫瘤細(xì)胞 分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑 7 。肝癌患者 血管增生和腫瘤發(fā)展中， PEDF 作為 VEGF 的拮抗因子， 起到了抑制作用。 對(duì)裸小鼠的在體實(shí)驗(yàn)以及鼠的肺癌模 型也同樣證明了 PEDF 對(duì)腫瘤的抑制作用。 其機(jī)制乃因 PEDF 減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤 新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在腫瘤的治療前 景上非常樂觀 8 。我們最近對(duì) PEDF 在膀胱癌中表達(dá)情況的初步 研究發(fā)現(xiàn)， PEDF 在膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常膀 胱組織，而且 PEDF 表達(dá)情況與膀胱癌的惡性程度以及 癌組織中微血管密度呈負(fù)

7、相關(guān)， 提示 PEDF 在膀胱癌的 發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用， PEDF 的正常表達(dá)可能 抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖， PEDF 有可能成為膀胱 癌生物學(xué)治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未 見此項(xiàng)研究的相關(guān)報(bào)道。因此我們?cè)O(shè)想，擴(kuò)大樣本量， 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織及非癌膀胱組織 中 PEDF 的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究 PEDF 在膀胱癌中的 表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析 PEDF 表達(dá)與膀胱癌分 期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系；通過研究膀胱癌組織中 PEDF 與 VEGF 表達(dá)的相關(guān)性， PEDF 與血小板反應(yīng)素 -1表達(dá)的相關(guān)性，探討膀癌組織中 PEDF 表達(dá)與腫瘤血 管形成的相關(guān)

8、性及可能的作用機(jī)制； 通過研究 PEDF 表 達(dá)與金屬蛋白酶 -9（ MMP-9 ）的相關(guān)性，探討 PEDF 表達(dá)與膀胱癌浸潤(rùn)的相關(guān)性； 通過研究 PEDF 表達(dá)與已 知的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子 （TNF- ）、白細(xì)胞介素 1（IL-1 ）、血栓調(diào)節(jié)蛋白 （thrombomodulin ）和白介素 8（ IL-8 ）等細(xì)胞因子表 達(dá)的相關(guān)性，探討 PEDF 表達(dá)對(duì)膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī) 制，從而探討 PEDF 在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展過程中的可能 作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺 病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、 以 PEDF 蛋白治療裸鼠膀 胱癌模型，進(jìn)一步探討 P

9、EDF 表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的 抑制作用以及對(duì)膀胱癌的治療效果 ,為膀胱癌的生物學(xué) 治療探索一種有效的新方法。參考文獻(xiàn)2 吳階平， 吳階平泌尿外科學(xué)，山東科學(xué)技術(shù)出 版社， 2004.5：898-917二、研究?jī)?nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵 研究的總體目標(biāo)：（1）研究 PEDF 表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級(jí)、 轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系， 探討 PEDF 表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、 發(fā) 展及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。（2）研究 PEDF 對(duì)膀胱癌細(xì)胞的治療效果， 為臨床治 療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法 研究的創(chuàng)新點(diǎn)： 本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究， 應(yīng)用 分子生物學(xué)方法從研究 PEDF 表達(dá)與膀胱癌的

10、發(fā)生、 分 期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討 PEDF 表達(dá)在 膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌 細(xì)胞株、以PEDF 蛋白治療裸鼠膀胱癌模型， 探討 PEDF 對(duì)膀胱癌的治療作用。目前，本項(xiàng)研究國內(nèi)、外尚未見 報(bào)道。本研究的順利完成，將為膀胱癌的生物學(xué)行為的 研究開辟了新的途徑， 也將為膀胱癌的生物學(xué)治療探索 一種新的有效方法。研究的主要內(nèi)容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 和相關(guān)細(xì) 胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究： 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱 組織中 PEDF表達(dá)狀況，并檢測(cè) VEGF 、T

11、SP-1、MMP-9 、 TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白( thrombomodulin )和 IL-8 的表達(dá)狀況；采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織和 非癌膀胱組織中的微血管密度( microvascular density ， MVD )，分析 PEDF 與 VEGF 、TSP-1、MMP-9 、TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白和 IL-8 表達(dá)的相關(guān)性， PEDF 與 MVD 的相關(guān)性； 并結(jié)合臨床資料分析研究 PEDF 表 達(dá)與膀胱癌患者 5年生存率之間的關(guān)系； 闡明 PEDF 表 達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系， 探討 PEDF 表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能

12、機(jī)制。(2) PEDF 對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的治療： 以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱 癌細(xì)胞株 ,以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株作為對(duì)照， 觀察檢測(cè) VEGF 、TNF- 的表達(dá)情況及膀胱癌細(xì)胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF 對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療： 以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱 癌模型。以 PEDF 蛋白(購自吉泰生物科技有限公司) 直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)作為治療組， 以未注射 PEDF 組為陰性對(duì)照組。觀察各組的 MVD 、VEGF 及 腫瘤增殖情況， 探討 PEDF 表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展中 的作用機(jī)制， 評(píng)估 PEDF 對(duì)膀胱癌的治療效果， 為進(jìn)一 步過度

13、到臨床應(yīng)用提供依據(jù)。需要解決的技術(shù)關(guān)鍵：(1) 連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱 癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率。(2) PEDF 定量檢測(cè)：我們已有對(duì)前列腺癌、腎癌、 膀胱癌等組織標(biāo)本的 PEDF 定量分析的基礎(chǔ)， 已形成較 成熟技術(shù)條件、設(shè)備和研究經(jīng)驗(yàn)。(3) 膀胱癌裸鼠模型的構(gòu)建。 我們已有成功構(gòu)建裸鼠 膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗(yàn)。研究方法：方法( 1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF和相關(guān)細(xì) 胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究：實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組膀胱癌組織非癌膀胱組織炎性B期CD 期期標(biāo)A 本期癌旁膀 正常膀膀胱胱組織 胱組織組織例 3030 30 30 數(shù)120 120 120應(yīng)用 SY

14、BR Green I 實(shí)時(shí)定量聚合酶 鏈反應(yīng)real-time PCR ）技術(shù),對(duì)膀胱癌、非癌膀胱組織中 PEDF進(jìn)行定量測(cè)定。Western blot 法檢測(cè) VEGF、TSP-1、 MMP-9。ELISA法檢測(cè) TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白、 IL-8濃度。免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本 MVD。 整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級(jí)、是否轉(zhuǎn)移、 5 年生存率。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 （使用 SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件 ）：PEDF與 VEGF表達(dá)的相關(guān)性。PEDF與 TSP-1 表達(dá)的相關(guān)性PEDF與 MMP-9表達(dá)的相關(guān)性-8 濃PEDF與 TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL

15、 度的相關(guān)性。PEDF與組織 MVD相關(guān)性。PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級(jí)）的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌 5 年生存率的相關(guān)性。方法（ 2）PEDF對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的治療：以連接有 PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌 細(xì)胞, 以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞作為對(duì)照， 檢測(cè) VEGF、TNF-濃度，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡情況，分析相關(guān)性。 以 RT- PCR法擴(kuò)增 PEDF基因。 將擴(kuò)增后的 PEDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀 胱癌細(xì)胞。并以空載轉(zhuǎn)染為對(duì)照。 Western blot 法檢測(cè) VEGF 、TSP-1、MMP-9表達(dá) 觀察膀胱癌細(xì)胞

16、增殖、侵襲、凋亡情況。 統(tǒng)計(jì)分析 方法（ 3）PEDF對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下， 建立裸鼠膀胱癌 模型。以 PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作為治 療組，以未注射 PEDF為陰性對(duì)照組。觀察兩組膀胱癌 組織 MVD、 VEGF表達(dá)情況、腫瘤增殖情況，評(píng)價(jià) PEDF對(duì)膀胱癌的治療效果 以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。將 PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè) MVD；應(yīng)用 Western blot法檢測(cè) VEGF、TSP-1、MMP-9；觀察腫瘤增殖、亡情況。分析 PEDF與 VEGF的相互作用關(guān)系及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制。技術(shù)路線：(

17、1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)及相關(guān)性研究：膀胱癌標(biāo)本癌旁膀胱組織標(biāo)正常膀胱組織標(biāo)炎性膀胱組織標(biāo)120 例本 120 例本 120 例本 120 例RT-PCR 檢測(cè) PEDF mRNA 表達(dá)Western blot 法檢測(cè) VEGF、 TSP-1、MMP-9ELISA 法檢測(cè) TNF- 、 IL-1 、 血栓調(diào) 節(jié)蛋白、 IL-8 濃度免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本微血管密度(MVD)結(jié)合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(2) PEDF 對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的治療：將 PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，檢測(cè) VEGF、 TSP-1、MMP-9、TNF-濃度，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、 凋亡情RT

18、PCR法擴(kuò)增 PEDF基因空載體 連接入腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株結(jié)果分析(3) PEDF 對(duì)裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察 PEDF與 VEGF、MVD相關(guān)性及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞 的抑制作用觀察微血 管密度 （MVD）VEGF、TSP-1、MMP-9定量測(cè) 定腫瘤凋亡、增 殖、侵襲情況結(jié)果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎(chǔ) 研究（包括分子生物學(xué)研究）和臨床研究，如：裸鼠膀 胱癌模型的建立、 CD44 基因、端粒酶、 P53和 Ras基 因等表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系、 VEGF 表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系 等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué) 研究的技術(shù)方法，如 RT-PCR 、 southe

19、rn 、 northern 雜交、 DNA 測(cè)序、擁有獨(dú)立的泌尿外科免疫、病理、 分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善，技術(shù)方 法先進(jìn)，擁有 PCR- 擴(kuò)增儀、酶標(biāo)儀、各種電泳槽、凝 膠成像設(shè)備、細(xì)胞房及各種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)備等 ,為本課題的 順利進(jìn)行提供了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細(xì)胞培 養(yǎng)、腺病毒載體構(gòu)建等技術(shù)， 積累了較豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。 最近我們開展了對(duì)膀胱癌、前列腺癌組織中 PDEF 表達(dá)的初步研究，掌握了對(duì)腫瘤組織包括膀胱癌 組織中 PDEF 表達(dá)的檢測(cè)方法， 對(duì)本課題的順利進(jìn)行提 供了便利條件。例如：已完成對(duì)膀胱腫瘤與正常膀胱組 織 PEDF 表達(dá)情況的對(duì)照性研究，初步結(jié)果顯示如下

20、:（1）定量 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見： PEDF 在正常膀胱組織中高表達(dá) , 而在膀胱癌組織中表達(dá)明顯 降低（見圖 1）。圖 1： 正常膀胱組織與膀胱癌組織PEDF定量 PCR注：N1，N2，N3：正常膀胱組織T1，T2，T3：膀胱癌組織GAPDH：內(nèi)參照M：為標(biāo)記分子量（2）在膀胱癌組織中 PEDF 低表達(dá)與微血管增殖相關(guān) （見圖 2）。預(yù)期成果：（1）明確測(cè)定出 PEDF 在膀胱癌中的表達(dá)情況以及 其與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。（2）PEDF 在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展過程中起重要作用。（3）PEDF 對(duì)膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨 床應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。成果以論文的形式表達(dá)， 并申請(qǐng)“ PEDF 治療裸鼠膀 胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著 5 7 篇，其中國 內(nèi)權(quán)威雜志 45 篇， SCI 收錄雜志 2 篇。申請(qǐng)成果鑒本課題實(shí)施過程中，形成一整套的細(xì)胞因子檢測(cè)方 法、膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱