蛋白質(zhì)的表達(dá)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)2NH4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（熱）（NH2）2CO In vitroin vitro protein synthesis systemProkaryotic Expression SystemE. coli, B. subtilisyeastEukaryotic Expression System insect cellsmammalian cells. Prokaryotic Expression Systemn Escherichia. coli, because of the wealth of knowledge regar

2、ding its biochemistry and genetics can be considered a good first choice for the preparation of proteins.n However, E. coli might not yield protein suitable for analysis, then other systems must be examined1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？n原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。n在原

3、核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與因與RNA聚合酶作用時(shí)，結(jié)構(gòu)基因則開(kāi)始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的聚合酶作用時(shí)，結(jié)構(gòu)基因則開(kāi)始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，與此同，與此同時(shí)，時(shí)， mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時(shí)立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時(shí)轉(zhuǎn)譯也完成，隨之轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。也被水解掉。n在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾加工去掉內(nèi)含子，

4、外顯子相連接，并修飾5和和3末端后才形成末端后才形成mRNA。而。而mRNA只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過(guò)加工、只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過(guò)加工、糖化、形成高級(jí)結(jié)構(gòu)。糖化、形成高級(jí)結(jié)構(gòu)。2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法origin of replicationselection markerMCS promoterterminatorribosome binding site Prokaryotic Expression SystemP tac = 3 P trp = 11 P lac啟動(dòng)子-35 區(qū)

5、序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋?啟動(dòng)子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子-LacLac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAP lacI Plac lacO

6、 lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專(zhuān)一位點(diǎn)結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 35、10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPLac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒(méi)有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的

7、表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型 Plac 更易操作。Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無(wú)誘導(dǎo)物情形下， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動(dòng) 子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的

8、，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá)IAA誘導(dǎo)啟動(dòng)子-TrpTrp 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) Trp 表達(dá)系統(tǒng) Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA Ptrp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動(dòng)子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的雜 合啟動(dòng)子。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于 trp 和 lacUV5 啟動(dòng)子（P tac = 3 P trp =

9、11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下，選用 tac 啟動(dòng)子比用 lacUV5 啟動(dòng)子更優(yōu)越。啟動(dòng)子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 雜合啟動(dòng)子-TacPL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中， PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子- PL 和 PR PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄

10、調(diào)控的機(jī)理 由 l 噬菌體 PE 啟動(dòng)子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的 阻遏物。cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與 噬菌體因子之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)控制cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 因此 PL 、 PR 表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來(lái)調(diào)控 PL 、 PR 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時(shí)以活性形式存在 在較高溫度（42）時(shí)失活脫落 T7 表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專(zhuān)一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一 體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。最常用啟動(dòng)

11、子- T7 T7 表達(dá)系統(tǒng) T7 噬菌體編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動(dòng)子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò) T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬 菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴(lài)于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方

12、式。 T7 RNA 聚合酶T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？啟動(dòng)子 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動(dòng)子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類(lèi)似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動(dòng)子E.Coli （DE3）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導(dǎo) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動(dòng)子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通過(guò)

13、熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平，尤其適用于表達(dá) 對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì)。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子E.Coli （CE6）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)cI857 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 雙質(zhì)粒系統(tǒng) 一個(gè)質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶有 T7 啟 動(dòng)子和目的基因 兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記 不能相同 調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合 酶的啟動(dòng)子調(diào)控類(lèi)型T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子 cI857 p15A ori

14、KanRColE1 ori AmpR3.2 The Terminatorn Stops RNA synthesis at specific points along the DNA templaten The enzyme stops polymerising nucleotides into RNA, releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter.n Features:-A dyad symmetry in the DNA, centered 15 to 20 nu

15、cleotides before the end of the RNA this leads to a transcript that can form an hairpin loop - Run of about six As in the DNA template which are transcribed into Us at the end of the RNAHow could these two structuralfeatures cause termination?強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)

16、錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA 混合物。過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過(guò)長(zhǎng)的 mRNA 往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強(qiáng)終

17、止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） 3.3核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)

18、大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個(gè)核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專(zhuān)一性結(jié)合 將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點(diǎn)，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點(diǎn) polymerase成功的實(shí)驗(yàn)都是一樣的，失敗的

19、實(shí)驗(yàn)各有各的不幸。成功的實(shí)驗(yàn)都是一樣的，失敗的實(shí)驗(yàn)各有各的不幸。 Eukaryotic Expression Systemn1.Yeast Expression Systemsn2. Baculovirus Expression Systemsn3. Animal cells Expression Systems2.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)n桿狀病毒只來(lái)源于無(wú)脊椎動(dòng)物。n基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80160 kb，其基因組可在昆蟲(chóng)細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。n用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病毒毒n多角體基

20、因缺失后，并不影響后代病毒的感染與復(fù)制，意味著重組病毒不需要輔助病毒的功能。n表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄后修飾的基因n研究蛋白的生物合成和體內(nèi)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制n表達(dá)大腸桿菌和酵母不能表達(dá)的含有內(nèi)含子的基因序列哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最理想的表達(dá)人類(lèi)基因的系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最理想的表達(dá)人類(lèi)基因的系統(tǒng)，應(yīng)為首選。應(yīng)為首選。體外翻譯系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)（In vitro translation system）又稱(chēng)之為體外蛋白）又稱(chēng)之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)質(zhì)合成系統(tǒng)(in vitro protein synthesis system)，是一種細(xì)胞裂解，是一種細(xì)胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)加入外源物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)

21、加入外源mRNA，能量物質(zhì)和，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng)氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng)SDSPAGE后可檢測(cè)出翻后可檢測(cè)出翻譯活性。譯活性。 常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種：常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種： 1. 兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物(reticylocyte lysate system) 2. 小麥胚抽提物小麥胚抽提物(wheat germ extract) 3. 兩棲動(dòng)物卵母細(xì)胞兩棲動(dòng)物卵母細(xì)胞 4. 原核體外翻譯系統(tǒng)原核體外翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng) Commonly confronted questionsnShould the protein(s) be exp

22、ressed in bacteria, in yeast, in insect cells or in human cells? nWhich expression vector should be used?n If bacterial expression is used, which strain(s) should be chosen?n Should one express the fulllength protein or a fragment thereof? nShould the protein be tagged, and which affinity tag is the

23、 best? nWhat is a good purification strategy, and what are the common pitfalls?nUnfortunately, because every protein is different, there can be no right answer to any of these questions a priori.How to choose protein expression system-There is no one expression system that does everything well, Each system has its strengths and weaknessesnThe expression of each cDNA or gene presents its own peculiar set of problems. The synthesis of foreign