“生物檢驗(yàn)檢疫”課程實(shí)驗(yàn)教案授課人：陳勇實(shí)驗(yàn)一：病料的采

1、“生物檢驗(yàn)檢疫”課程實(shí)驗(yàn)教案授課人：陳勇實(shí)驗(yàn)一：病料的采集及病原菌的分離和培養(yǎng)方法(一)病料采集學(xué)習(xí)目的：了解常見(jiàn)病料的采集部位，掌握病料采集注意事項(xiàng)，學(xué)會(huì)進(jìn)行常見(jiàn)病料采集。一：血液的采集根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目及需要血液料的多少，可以選用靜脈采血或心臟采血。（一） 靜脈采血魚(yú)是尾靜脈；馬，牛，羊犬，貓一般多在頸靜脈；成年豬在耳靜脈；6個(gè)月以?xún)?nèi)的豬在前腔靜脈；禽在翅靜脈采血。前腔靜脈的采血術(shù)是：豬仰臥，拉直兩前肢使兩前肢向后與體中線(xiàn)平行。手持針管，針頭斜向后內(nèi)方與地面呈60度角，向右側(cè)或左側(cè)胸前窩刺入，進(jìn)針23厘米即可抽出血液。術(shù)后局部常規(guī)消毒。（二） 末梢或小靜脈采血馬牛可在耳尖部采血：局部剪毛，酒精消

2、毒，用18號(hào)針頭刺入1厘米左右，血液即可流出。豬羊兔等可穿刺耳邊緣小靜脈。（三） 心臟采血禽或試驗(yàn)小動(dòng)物需要血量較多時(shí)可采用本法。禽的采血：右側(cè)臥保定，左側(cè)胸部向上，取一個(gè)10毫升注射器，接上長(zhǎng)約5厘米的針頭，從胸骨脊前端至背部下凹處連接線(xiàn)的中點(diǎn)，垂直或稍向前內(nèi)方刺入23厘米即可。兔或豚鼠等的采血：在胸部左側(cè)觸及心臟跳動(dòng)處垂直刺入，邊刺邊抽注射器內(nèi)塞，將血取出。二：其他病料采集（一） 乳汁的采集乳頭及術(shù)者的手用新潔爾滅消毒，將最初擠出的乳汁棄去，采1020毫升左右乳汁與滅菌容器中。（二） 膿汁，鼻液，水皰液，水腫液的采集用滅菌棉拭子蘸取膿汁于滅菌試管中。未破的膿腫，水皰液，水腫液等無(wú)菌注射器吸

3、取，注入無(wú)菌容器中。尸體剖檢后胸水，心包液，關(guān)節(jié)囊液等可用滅菌吸管吸取，置于滅菌容器中（三） 糞便的采集以清潔玻棒挑取新鮮糞便少許（約1克）或用棉拭子自直腸內(nèi)掏取，置于小瓶?jī)?nèi)。（四） 腸管的采集用線(xiàn)扎緊一段腸管（約6厘米）兩端，結(jié)外剪下置于滅菌容器中。（五） 膽汁的采集整個(gè)膽囊置于塑料袋中或以無(wú)菌注射器吸取膽汁于滅菌容器中。（六） 腦和脊髓的采集采取腦，脊髓于適當(dāng)保存液中，或?qū)⒄麄€(gè)頭割下，包于鋟過(guò)0.1%升汞的紗布中，于木箱中送檢。（七）實(shí)質(zhì)臟器的采集選擇典型病變連同一部分正常組織，切下一，二塊，每塊不小于4厘米*2厘米*2厘米。（八）魚(yú)體表、鰓表面的采集(二)病原菌的分離和培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

4、（1） 掌握無(wú)菌操作的概念和基本操作技術(shù)。（2） 了解細(xì)菌常用培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件（3） 了解平板劃線(xiàn)分離菌種的原理和操作要點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)原理： 微生物的接種技術(shù)是微生物學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。在微生物學(xué)的科學(xué)試驗(yàn)及發(fā)酵生產(chǎn)中，都要把一種微生物移接到另一滅過(guò)菌的新鮮培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)繁殖并獲得代謝產(chǎn)物。根據(jù)不同的接種方法，如斜面接種、液體接種、平板接種、穿刺接種等。接種方法不同，常有不同的接種工具，如接種針、接種環(huán)、接種鉤、滴管、移液管、涂布器等。接種的菌種都是純培養(yǎng)的微生物，為了解保純種不被雜種菌污染，在接種過(guò)程中必須進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。三、實(shí)驗(yàn)材料： 燒杯 、 玻璃棒、 天平、 電爐、

5、培養(yǎng)基 、蒸餾水、 接種環(huán) 、 培養(yǎng)皿（12個(gè)）、試管（20支）、 高壓滅菌鍋、 無(wú)菌操作臺(tái)、 酒精燈、 溫箱四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、配制培養(yǎng)基：用天平稱(chēng)取瓊脂培養(yǎng)基粉末45克，加入100毫升的蒸餾水，用電爐加熱直至培養(yǎng)基徹底溶解。2、分裝試管：將溶解的培養(yǎng)基分裝入試管，且分裝入的培養(yǎng)基應(yīng)不超過(guò)試管高度的三分之一，塞上木塞。 3、滅菌：將裝入培養(yǎng)基的試管、培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿用報(bào)紙包扎好，一起放入高壓滅菌鍋，126度滅菌15分鐘，等冷卻后將試管斜放，制成斜面（斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)的一半）。4、制平板培養(yǎng)基：將滅完菌的培養(yǎng)皿與培養(yǎng)基移至無(wú)菌操作臺(tái)，在無(wú)菌條件下制成平板培養(yǎng)基，待用。5、取菌種：（1）每個(gè)試管

6、中放入1毫升的生理鹽水。分成三組。（2）用接種環(huán)取魚(yú)鰓、身體與尾部的細(xì)菌，分別放于1號(hào)試管中。（3）1號(hào)試管取一半帶菌液體放入2號(hào)試管中，振蕩，再取一半帶菌液體加入3號(hào)試管，振蕩，取一半液體加入4號(hào)試管，振蕩。6、分離細(xì)菌：（1）在無(wú)菌條件下操作，點(diǎn)燃酒精燈后，左手持皿，底朝下蓋朝上，以無(wú)名指和小指托底，用拇指、食指和中指將皿蓋揭開(kāi)成20。左右的角度（角度愈小愈好，以免空氣中細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染）。（2）右手持接種環(huán)于酒精燈上灼燒滅菌，待冷，取帶菌液體于平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)分離培養(yǎng)。（3）劃線(xiàn)完畢，燒灼接種環(huán)，將培養(yǎng)皿蓋好，用標(biāo)簽做好標(biāo)記，倒置，待培養(yǎng)。7、培養(yǎng)細(xì)菌：將培養(yǎng)皿放入37。C溫箱中

7、培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：培養(yǎng)出多個(gè)單菌落。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定方法(一)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饧?xì)菌的個(gè)體形態(tài)和菌落培養(yǎng)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理： （一）菌體形態(tài)觀察細(xì)菌個(gè)體微小，觀察個(gè)體大小、外形、排列、特殊結(jié)構(gòu)時(shí)，一般借助普通光學(xué)顯微鏡。 細(xì)菌的基本形態(tài)可分為三類(lèi)：球菌、桿菌和螺旋菌。 1、球菌 菌體呈球形。按其分裂的方向和分裂后排列情況不同，可分為雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌等。雙球菌在一個(gè)平面上分裂，分裂后菌體成對(duì)排列，如腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌；鏈球菌連續(xù)不斷地在一個(gè)平面上分裂，呈鏈狀排列，如化膿鏈球菌；葡萄球菌是在多個(gè)不同角度平面上做不規(guī)則分裂，分裂后菌體堆積成葡萄串狀，如金黃色葡

8、萄球菌。2、桿菌 菌體呈桿狀或近似桿狀。各種桿菌長(zhǎng)短粗細(xì)差別很大，短的幾乎呈球形，長(zhǎng)的可呈絲狀，桿菌的兩端形狀在鑒定細(xì)菌時(shí)具有一定的意義。大多數(shù)桿菌兩端鈍圓，如大腸桿菌；有的平切，如炭疽桿菌；有的尖細(xì)，如梭狀桿菌；有的末端膨大似棒狀，如百喉?xiàng)U菌；有的呈球桿形，如多殺性巴氏桿菌。桿菌大多數(shù)呈散在排列，也有的呈鏈狀排列，如炭疽桿菌，有些形成側(cè)枝稱(chēng)分枝桿菌，如結(jié)核分枝桿菌。3、螺旋菌 菌體彎曲。根據(jù)其彎曲的程度和螺旋數(shù)，又可分為孤菌、螺菌和彎桿菌。 孤菌的菌體只有一個(gè)彎曲呈孤?tīng)?，如霍亂孤菌；螺菌的菌體有兩個(gè)以上彎曲呈螺旋形，如鼠咬癥螺菌；彎桿菌呈孤形、螺旋形或S形，如結(jié)腸空腸彎桿菌。 某些細(xì)菌除具有

9、基本結(jié)構(gòu)外，還具有某些特殊結(jié)構(gòu)，如莢膜、鞭毛、芽孢等，通過(guò)特殊染色法加以觀察，對(duì)鑒別細(xì)菌的種類(lèi)具有一定意義。（二）菌落性狀觀察 各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，常表現(xiàn)出一定的特征，如在特殊培養(yǎng)基內(nèi)所表現(xiàn)的發(fā)育情況，菌落的形態(tài)和色素的產(chǎn)生等。這對(duì)于細(xì)菌菌屬的鑒別，具有重要的意義。 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，由單個(gè)菌細(xì)胞固定一點(diǎn)而大量繁殖，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（一般為1824小時(shí)）的孵育，在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)，這種集團(tuán)稱(chēng)為菌落。每一種細(xì)菌有它一定的菌落形態(tài)，其大小、隆起或扁平、表面的性質(zhì)、光澤、色素的產(chǎn)生、邊緣的形狀等各有特點(diǎn)，所以，菌落的形態(tài)在識(shí)別細(xì)菌上有一定的意義。例如葡萄球菌在瓊脂平皿上，由

10、于產(chǎn)生色素的不同，形成各種顏色之圓形而突起的菌落；炭疽桿菌形成扁平、干燥、邊緣不整齊的波紋狀菌落，用放大鏡觀察時(shí)，它們呈卷發(fā)樣構(gòu)造；腸道桿菌屬的細(xì)菌形成圓形、濕潤(rùn)、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌形成細(xì)小露珠狀菌落。 觀察菌落形態(tài)特征時(shí)，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡檢查，必要時(shí)用顯微鏡檢查。 觀察的內(nèi)容和方法主要有以下幾個(gè)方面：（1） 大小 菌落的大小以毫米來(lái)表示，一般不足1毫米者為露滴狀菌落，12毫米者為小菌落，24毫米者為中等大菌落，46毫米或更大者稱(chēng)為大菌落或巨大菌落。（2） 形狀 菌落的外形有圓形、不整形、樹(shù)根形、葡萄葉形等。（3） 邊緣 邊緣有整齊、鋸齒狀、網(wǎng)狀、樹(shù)葉

11、狀、蟲(chóng)蝕狀、放射狀及卷發(fā)狀等。（4） 表面性狀 觀察其是否平滑或粗糙，是否有皺仄狀，蝸旋狀，甚至有子菌落等。（5） 隆起度 有隆起、輕度隆起、中央隆起；反之，略有扁平、陷凹或堤狀等。（6） 顏色及透明度 有無(wú)色、灰白色及產(chǎn)生各種色素者；有無(wú)光澤、透明、半透明及不透明等區(qū)別。（7） 硬度 有黏液狀、脂狀、干燥或濕潤(rùn)等。三、實(shí)驗(yàn)器材：解剖鏡四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：觀察多種多個(gè)單菌落。(二)細(xì)菌的染色觀察一、實(shí)驗(yàn)原理：（1）簡(jiǎn)單染色：只用一種染料使細(xì)菌染色，該法可用于觀察細(xì)菌的形態(tài)，難于辨別細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。（2）革蘭氏染色：G+和G-其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分不同，G-菌的細(xì)胞壁中含有較多的易被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，并

12、且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，在使用乙醇或丙酮脫色時(shí)，因類(lèi)脂質(zhì)溶解增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌被脫色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅復(fù)染后即成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類(lèi)脂質(zhì)含量少，脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。（3）芽孢染色：細(xì)菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁較厚，對(duì)染料的透性差，不易著色，但是一旦著色又難以脫色。通常，芽孢染色采用弱堿性染料孔雀綠在加熱條件下進(jìn)行。染色完畢，用自來(lái)水沖洗。因孔雀綠是弱堿性染料，與菌體結(jié)合力較差，因此易被水沖洗掉，而進(jìn)入芽孢中的孔雀綠卻難以溶出。水洗后，再用一種呈紅色的堿性染

13、料復(fù)染，使菌體和芽孢呈現(xiàn)不同的顏色。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備： 染色劑的配置： 1、堿性美藍(lán)染色液 甲液：美藍(lán) 0.3克 95%酒精 30毫升 乙液：0.01%苛性鉀溶液 100毫升 先配美藍(lán)飽和液（甲液），將美藍(lán)放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后，把甲、乙兩液混合，越夜后用濾紙過(guò)濾即成。新鮮配制的美藍(lán)染色不好，陳舊的染色好。 2、革蘭氏染色液 （1）草酸銨結(jié)晶紫溶液 甲液：結(jié)晶紫 2克 95%酒精 20毫升 乙液：草酸銨 0.8克 蒸餾水 80毫升 將結(jié)晶紫放入研缽中，加酒精研磨均勻，然后將完全溶解的乙液與甲液混合即成。 （2）盧戈氏碘液 碘1克、碘化鉀2克，蒸餾水300毫升。將碘化鉀放入研缽中，加入少

14、量蒸餾水，使其溶解，在放入已磨散的碘片，徐徐加水，同時(shí)充分磨勻，待碘片完全溶解后，把余下的蒸餾水倒入，再裝于瓶中。 （3）稀釋石炭酸復(fù)紅溶液 取堿性復(fù)紅酒精飽和溶液（堿性復(fù)紅10克溶于95%酒精100毫升中）1毫升和5%石炭酸水溶液9毫升混合，即成稀釋石炭酸復(fù)紅溶液。 3、瑞氏染色液 取瑞氏染料0.1克，純中性甘油1毫升，在研缽中混合研磨，再加甲醇60毫升，使其溶解，裝入中性瓶中越夜，次日過(guò)濾，盛于棕色瓶中，保存于暗處。保存越久，染色越好。 4、姬姆薩染色液 取姬姆薩染料0.6克，加入甘油50毫升，置于5560。C水浴箱中，2小時(shí)后加入甲醇50毫升，靜置1天以上，過(guò)濾后即可使用。三、實(shí)驗(yàn)步驟：

15、 （一）、一般染色 1、美藍(lán)染色法 經(jīng)涂片、干燥、固定后，滴加美藍(lán)于涂片上，使之覆蓋涂面，染色23分鐘，用水沖洗，晾干或用吸水紙輕壓吸干后即可鏡檢，菌體呈藍(lán)色。 2、革蘭氏染色法 經(jīng)涂片、干燥、固定后滴加適量草酸銨結(jié)晶紫液于涂面上（以蓋滿(mǎn)細(xì)菌涂面為度），初染1分鐘后水洗。再滴加盧戈氏碘液覆蓋1分鐘，水洗（此步水洗可省略）。加95%酒精脫色約30秒至1分鐘，立即水洗。最后滴加石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染1分鐘，水洗，自干或用吸水紙吸干后鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 （二）、特殊染色法 對(duì)細(xì)菌的莢膜、芽孢、鞭毛等特殊結(jié)構(gòu)，因其不易著色，通常采用特殊的莢膜染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法來(lái)進(jìn)

16、行染色。 1、莢膜染色法 （1）希司氏莢膜染色法 細(xì)菌涂片，甲醇固定后，用一小塊濾紙片覆蓋于涂膜上，滴加結(jié)晶紫染液，并置于火焰上略加熱至發(fā)生蒸汽為止（約近1分鐘），傾去染液，除去濾紙片，再用20%硫酸銅溶液沖洗，待干后鏡檢。菌體呈紫色，莢膜呈淡藍(lán)色。 （2）駱氏美藍(lán)莢膜染色法 細(xì)菌涂片、固定后，用久貯的駱氏美藍(lán)液染色12分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈藍(lán)色，莢膜呈淡紅色。 2、芽孢染色法 固定后的涂膜上滴加5%孔雀綠液微微加熱染色0.51分鐘，到發(fā)生蒸汽為止，待冷后水洗，再滴加沙黃液復(fù)染0.5分鐘，水洗、干燥后鏡檢。芽孢成綠色，菌體呈淡紅色。 3、鞭毛染色法 取鞭毛菌液，干燥后滴加戶(hù)田氏染色液，

17、染色約0.55分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈深紅色，鞭毛呈淡紅色。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的生化特性鑒定細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)是菌種鑒定的重要依據(jù)，通過(guò)細(xì)菌的生理生化反應(yīng)了解細(xì)菌在不同基質(zhì)中的各種代謝途徑和產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物及在菌種鑒定中的重要性，本實(shí)驗(yàn)選做其中的9個(gè)實(shí)驗(yàn)，包括硫化氫試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚實(shí)驗(yàn)）、糖發(fā)酵試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P試驗(yàn)）、甲基紅試驗(yàn)（M.R試驗(yàn)）、尿素酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)。一、硫化氫試驗(yàn) 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（1）了解硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)的用途及原理。 （2）學(xué)習(xí)硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)的操作技術(shù)。 2、實(shí)驗(yàn)原理： 某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、精

18、氨酸）生成硫化氫，硫化氫遇到鉛（或鐵、鉍）等重金屬鹽，能形成黑色的硫化鉛（或硫化亞鐵、硫化鉍）沉淀物。由于反應(yīng)形成的硫化氫易被氧化，通常采用穿刺接種，以及在培養(yǎng)基中加入硫代硫酸鈉，使硫化氫不致被氧化。 3、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種針 恒溫箱等 4、實(shí)驗(yàn)步驟 用穿刺接種法接試驗(yàn)菌于硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)24天 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)基中有黑色物質(zhì)者，為硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。二、靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）： 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（1）了解吲哚試驗(yàn)的反應(yīng)原理和用途。 （2）學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)的操作技術(shù)。 2、實(shí)驗(yàn)原理： 某些細(xì)菌具有色氨酸水解酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚

19、（靛基質(zhì)）。吲哚本身沒(méi)有顏色，不能直接看見(jiàn)，但加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑，使之與吲哚作用，可生成紅色的玫瑰吲哚。 3、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種環(huán) 洗耳球 1ml吸管 恒溫箱等 對(duì)二甲基氨基苯基苯醛試劑：對(duì)二甲基氨基苯甲醛1克，95%酒精95毫升溶解后，再加入濃鹽酸50毫升 4、實(shí)驗(yàn)步驟： 將細(xì)菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)12天，必要時(shí)可培養(yǎng)45天，觀察結(jié)果。 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 取培養(yǎng)好的試管，加入約0.5ml乙醚，振搖均勻后，靜置分層，再沿試管壁加入約1.5ml的吲哚試劑。陽(yáng)性者，在上層的乙醚層呈玫瑰紅色，否則為陰性。三、糖發(fā)酵試驗(yàn)： 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（1）了解

20、糖發(fā)酵試驗(yàn)的作用及原理 （2）學(xué)習(xí)糖發(fā)酵試驗(yàn)的操作技術(shù) （3）觀察細(xì)菌發(fā)酵糖能力的區(qū)別 2、實(shí)驗(yàn)原理： 糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定中尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類(lèi)為碳源和能源，但是各種細(xì)菌在分解糖類(lèi)的能力上有很大差別。某些細(xì)菌能分解某些單糖或雙糖產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、甲酸、琥珀酸）并產(chǎn)生氣體（如CO2、H2、CH4等），或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。產(chǎn)酸者可使培養(yǎng)基的酸堿指示劑變色，產(chǎn)氣者可看見(jiàn)杜氏管中形成氣泡，否則無(wú)上述現(xiàn)象。 3、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種環(huán) 恒溫箱 4、實(shí)驗(yàn)步驟： 利用內(nèi)裝倒立小發(fā)酵管的糖培養(yǎng)基（以溴甲酚紫為指示劑），接種被檢菌，待其發(fā)育后觀察培

21、養(yǎng)基中指示劑顏色的變化。 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 如細(xì)菌能分解某種糖類(lèi)產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液有紫色變?yōu)辄S色；如不分解糖，則仍呈紫色；如分解后產(chǎn)氣，則在小管內(nèi)積有氣泡。四、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P試驗(yàn)） 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（1）了解V-P試驗(yàn)的反應(yīng)原理及用途 （2）學(xué)習(xí)V-P試驗(yàn)的操作技術(shù) 2、實(shí)驗(yàn)原理： V-P試驗(yàn)是檢驗(yàn)微生物利用葡萄糖產(chǎn)酸的能力。產(chǎn)氣腸桿菌利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，可進(jìn)一步使一部分丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在強(qiáng)堿環(huán)境中，能被空氣中的氧氣氧化，生成雙乙酰，雙乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成紅色化合物。此即為V-P試驗(yàn)陽(yáng)性。當(dāng)在試管中加入萘酚時(shí)，可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。 如果某細(xì)

22、菌在4天期間M.R和V-P反應(yīng)均為陽(yáng)性，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，以確定生成的酸是否能轉(zhuǎn)化成乙酰甲基甲醇。對(duì)于一些發(fā)酵遲緩的微生物可能實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，也應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，以判斷微生物是否能利用葡萄糖產(chǎn)生大量酸。對(duì)于一種微生物，M.R試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P反應(yīng)一定陰性，反之亦然。 3、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種環(huán) 恒溫箱等 6%萘酚酒精溶液 40%氫氧化鉀溶液 4、實(shí)驗(yàn)步驟： 被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中培養(yǎng)27天后取出，按每毫升培養(yǎng)基加入0.5毫升6%-萘酚酒精溶液（又稱(chēng)為V-P試劑甲），在加入0.2毫升40%氫氧化鉀溶液（又稱(chēng)為V-P試劑乙），振搖混合均勻，靜置觀察24小時(shí)， 5

23、、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 凡液體呈紅色者為V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，不變色者為陰性。 五、甲基紅試驗(yàn)（M.R實(shí)驗(yàn)）： 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?（1）了解甲基紅試驗(yàn)的反應(yīng)原理和用途 （2）學(xué)習(xí)甲基紅試驗(yàn)的操作技術(shù) 2.實(shí)驗(yàn)原理： 多數(shù)細(xì)菌能分解葡萄糖，但分解葡萄糖的途徑和產(chǎn)物不完全相同。例如大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，若繼續(xù)代謝還能生成其它有機(jī)酸和醛、醇等化合物。其中，大腸桿菌所產(chǎn)生的酸能使培養(yǎng)液的pH降到4.2左右或更低，可是甲基紅指示劑變成紅色，并至少持續(xù)4天之久。因此，甲基紅試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱。但這些微生物可將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步代謝，在4天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)生成中性化合物，不具有使甲基紅變紅的

24、能力。因此進(jìn)行這項(xiàng)試驗(yàn)時(shí)，觀察時(shí)間顯得很重要。腸道桿菌生長(zhǎng)在37。C以下4天觀察為宜，其他細(xì)菌也可參照同樣時(shí)間。 3、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種環(huán) 恒溫箱等 M.R試劑：甲基紅0.1克溶于95%酒精300毫升中 4、實(shí)驗(yàn)步驟： 將被檢菌培養(yǎng)在葡萄糖蛋白胨水中，在37。C條件下培養(yǎng)27天后，在培養(yǎng)液中加入M.R試劑數(shù)滴（56滴）。 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 液體成紅色者為陽(yáng)性，黃色者為陰性，橙色者為可疑。 六、尿素酶實(shí)驗(yàn)： 1、實(shí)驗(yàn)原理： 某些細(xì)菌（如布氏桿菌）含有尿素酶，能分解培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)生氨，因而培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，于是酚紅指示劑呈現(xiàn)紅色（陽(yáng)性反應(yīng)） 2、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)菌 培養(yǎng)基 酒精棉球 酒精燈 接種環(huán) 恒溫箱等 3、實(shí)驗(yàn)步驟： 將被檢菌接種于含有酚紅指示劑的尿素培養(yǎng)基中，放37。C溫箱中培養(yǎng)2448小時(shí)后觀察結(jié)果。 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 如細(xì)菌能分解尿素則培養(yǎng)基因