《環(huán)境微生物學(xué)實驗》多媒體課件下載-海南大學(xué)Haina

1、 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 環(huán)境微生物學(xué)實驗環(huán)境微生物學(xué)實驗 環(huán)境科學(xué)實驗教學(xué)示范中心 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 n本課程是環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境等專業(yè)開設(shè)的一門獨立的專業(yè)基礎(chǔ)課實驗 ,其宗旨是著重訓(xùn)練學(xué)習(xí)掌握微生物學(xué)最基本的操作技能，如顯微鏡的使用方法，微生物的基本形態(tài)觀察，細菌染色技術(shù)，土壤、水體、空氣中微生物的檢測等。了解微生物的基本知識，通過觀察具體材料和實驗結(jié)果以加深理解和鞏固課堂講授的某些環(huán)境微生物學(xué)理論；同時，通過實驗，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力。本課件的內(nèi)容主要包括：熒光原位雜交法檢測活性污泥中的硝化細菌、微生物的接種技術(shù)、細菌染色及微生

2、物觀察，土壤、空氣微生物檢測、水體中大腸菌群細菌的檢測等。環(huán)境微生物學(xué)實驗環(huán)境微生物學(xué)實驗多媒體課件簡介多媒體課件簡介 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗一實驗一細菌染色法及微生物的觀察細菌染色法及微生物的觀察 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細菌蛋電質(zhì)等電點較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH值下降時，細菌所帶

3、正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料如伊紅美藍、伊紅天青等。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態(tài)的方法難于辨別細菌細胞的構(gòu)造。 革蘭氏染色法法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類，是細菌學(xué)上是常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G菌和G菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細菌就

4、被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固無菌操作技求，掌握細菌及其結(jié)構(gòu)的染色技術(shù)。內(nèi)容： 1、學(xué)習(xí)細菌單染色操作技術(shù)。 2、學(xué)習(xí)革蘭氏染色技術(shù)。 3、學(xué)習(xí)細菌的莢膜、芽孢及鞭毛染色方法。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、實驗材料和用具1、單染色法：（1）大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌種。（2）呂氏美藍染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色素液或碳素

5、墨水、香柏油、二甲苯、無菌水（3）顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、無菌牙簽。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2、革蘭氏染色：（1）黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌（E.coli）菌液，待測菌菌液l2種；（2） 革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、（3） 香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 3、莢膜染色： (l)在阿須貝(Ashby)無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天的團褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培養(yǎng)23天

6、的硅酸鹽細菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸鈉美蘭染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色液。(3)載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 4、鞭毛染色：(1) 在牛內(nèi)膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)1924小時的假單孢菌(Pseudomonas.sp)，此培養(yǎng)體在取用前經(jīng)過每日移植代，連續(xù)移植57代。(2)新配制的費氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)無菌水、無菌空試管、凹玻片。蓋玻片、潔凈載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)2436小

7、時的枯草桿菌或者蘇云金桿菌。(2)載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、鑷子。(3)顯微鏡。 (4)香柏油、二甲苯、擦鏡紙(5)孔雀綠染色液、蕃紅染色液。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 三、操作步驟一一、單染色法、單染色法 （1）涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水（圖410a），用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約11.5cm2（圖410b）。 （2）干燥 將涂片于室溫中自然干燥。 （3）固定 手執(zhí)載片端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火23次。在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細菌形態(tài)毀壞(圖410c)。 海南大學(xué)環(huán)

8、境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （4）染色 將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min(圖410d)。 （5）水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來水的細水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止(圖410e)。 （6）干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體(圖410f)。 （7）待標本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖410 單染色方法 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （二） 革蘭氏染色法1、制片 （1 ） 涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，

9、用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。 （2）干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。 （3）固定 目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細菌涂片面向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2、染色（1）初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加盧戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30s至1min)。（4）復(fù)染 滴加

10、石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗。（5）用濾紙吸干，油鏡鏡檢。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 3、結(jié)果 革蘭氏陽性菌染成籃紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。4、檢測未知菌 用以上方法對未知面進行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染 色結(jié)果。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 1石炭酸復(fù)紅染色(1)取培養(yǎng)了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(莢膜是多糖類物質(zhì)，不可用火焰烘干)。(2)滴入12滴95乙醇固定(不可加熱固定)。(3)加石炭酸復(fù)紅染液染色12min，水洗，自然干燥。(4)在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，在以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。(5)干燥后用

11、油鏡觀察。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。 （三）莢膜染色法 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2背景染色(1)先加1滴墨水于潔凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油鏡觀察。背景灰色，菌體較暗在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 3李夫森氏硼酸鈉美蘭染色（1）取在阿須貝氏無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的硅酸鹽細菌少許，制成干燥涂片(不要加熱固定)。（2）加李夫森氏染色液染色l0min，傾之染液(勿用水洗)。（3）加硼酸鈉美蘭染色液染色5min，水洗，晾干。（4）

12、油鏡視察可見莢膜被染成紅色，菌體處成藍色。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （四）鞭毛染色法1方法一：（1）用接種環(huán)由培養(yǎng)1820h的斜面上取假單胞菌菌體少許，用菌滴制片法檢查細菌的運動性。如果菌體的運動性很強，則可作鞭毛染色。（2）用34mL無菌水，將培養(yǎng)體洗下，移入另一無菌試管中，適溫培養(yǎng)10min，再檢查運動性。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （3）用無菌吸管由懸液上部取一小滴，置于一清潔載玻片的一端，將玻片傾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成23條菌液帶。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用剛剛過濾的鞭毛染色液A染色5min(不要加熱)。（5）傾去A液，加鞭毛

13、染色液B染色10min。用蒸餾水輕輕沖洗，晾干。（6）用齊氏石炭酸復(fù)紅染色23min。輕輕沖洗，晾干(不能用吸水紙吸干)。（7）先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡檢查。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2方法二：（1）制涂片：先加少量無菌蒸餾水于凹載玻片的凹窩中再從培養(yǎng)10h左右的斜面菌苔上取菌一環(huán)，輕放在凹窩水面上(不要攪動)，放30度溫箱靜置510min取出，從凹窩水面上輕輕取菌液一環(huán)，輕放在干凈的載玻片上(不要涂抹)，放回溫箱，讓其自然干燥(不要加熱固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水輕輕沖洗，讓其自然干燥。（3）鏡檢：用油鏡觀察。

14、 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （五）芽孢染色法1方法一：(1)取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定。(2)于載片上滴人35滴5孔雀綠水溶液。(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5)用0.5沙黃水溶液(或0.05堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6)制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2方法二：(1)加12滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)培養(yǎng)18

15、24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分均勻打散，制成濃稠的菌液。 (2)加5孔雀綠水溶液23滴于小試管中用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。 (3)將此試管浸干沸水浴(燒杯)中，加熱1520min。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片經(jīng)過微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(6)加沙黃水溶液，染23min后，傾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、注意事項1載玻片要潔凈無脂，否則菌液涂不開。涂片時，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。3

16、.在革蘭氏染色過程中脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌，另外，老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。3.莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。4.鞭毛染色液最好當(dāng)日配置，次日使用則鞭毛染色淺，觀察效果差。染色時一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。5供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五、實驗報告(一)繪圖1單染色后觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖。2大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。3金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野圖。4褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。4繪出你所觀察到的細菌的

17、形態(tài)及鞭毛著生情況。6枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。(二)單染色法操作要點。(三)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進行結(jié)果分析。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 六、問題和思考1涂片在染色前為什么要先進行固定?固定時應(yīng)注意什么問題?2制備染色裝片時應(yīng)注意哪些事項，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？3什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?4試分析革蘭氏染色法在細菌分類中的意義。5組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?6鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?7根據(jù)你的實驗體會，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制? 海南大

18、學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗二實驗二微生物的接種技術(shù)微生物的接種技術(shù) 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 微生物接種技術(shù)是進行微生物實驗和相關(guān)研究的基本操作技能。 無菌操作是微生物接種技術(shù)的關(guān)鍵。斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種操作均以獲得生長良好的純種微生物為目的。 由于接種方法不同，采用的接種工具也有區(qū)別，如固體斜面培養(yǎng)體轉(zhuǎn)接時用接種環(huán)；穿刺接種時用接種針，液體轉(zhuǎn)接用移液管等。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一、實驗?zāi)康模毫私飧鞣N微生物接種方法：斜面接種技術(shù)液體接種技術(shù)固體接種技術(shù)穿刺接種技術(shù) 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、實驗材料和用具：已滅菌培養(yǎng)基、接種環(huán)、

19、接種針、酒精燈、移液管、記號筆 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 三、實驗步驟：1、斜面接種技術(shù) 斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植 至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的一種接種方法。具體操作如下：(1)貼標簽 接種前在試管上貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口約23cm的位置。(若用記號筆標記則不需標簽)。 。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 (2)點燃酒精燈。(3)接種 用接種環(huán)將少許菌種移接到貼好標簽的試管斜面上。操作必須按無菌操作法進行。簡述如下：1)手持試管 將菌種和待接斜面的兩支試管用大姆指和其他四指握在左手中使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并

20、使它們位于水平位置。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2)旋松管塞 先用有于松動棉塞或塑料管蓋，以便接種時拔出。3)取接種環(huán) 右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌然后將有可能伸入試管中的其余部分均灼燒滅菌，重復(fù)此操作再灼燒一次。4)拔管塞 用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，然后讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)。見圖46(a)所示。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖46 試管拔塞后過火滅菌和取菌 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 8)塞管塞 取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動時納入不潔空氣。9)將接種環(huán)灼燒滅

21、菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 2、液體接種技術(shù) (1)用斜面菌種接種液體培養(yǎng)基時，有下面兩種情況：如接種量小，可用接種環(huán)取少量菌體移入培養(yǎng)基容器(試管或三角瓶等)中，將接種環(huán)在液體表面振蕩或在器壁上輕輕摩擦把菌苔散開，抽出接種環(huán)，塞好棉塞，再將液體搖動，菌體即均勻分布在液體中。如接種量大，可先在斜面菌種管中注入定量無菌水接種環(huán)把菌苔刮下研開，再把菌懸液倒入液體培養(yǎng)基中，倒前需將試管口在火焰上滅菌。(2)用液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時，可用無菌的吸管或移液管吸取菌液接種。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 3、固體接種技術(shù) 固體接種最普遍的形式是接種固體菌

22、制劑。因所用菌種或種子菌來源不同分為：1)用菌液接種固體料 可用菌苔刮洗制成的懸液。接種時可按無菌操作法將菌液直接例入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻。注意接種所用菌液量要計算在固體料總加水量之內(nèi)，否則往往在用液體種子菌接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。2)用固體種子接種固體料 包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌，直接把接種材料混入滅菌的固體料。接種后必須充分攪拌使之混合均勻。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 4、穿刺接種技術(shù) 穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。經(jīng)穿刺接種后的菌種常作為保藏菌種的一種形式，同時也是檢查

23、細菌運動能力的一種方法，它只適宜于細菌和酵母的接種培養(yǎng)。具體操作如下：(1)貼標簽。(2)點燃酒精燈。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 (3)穿刺接種，方法如下：1)手持試管。2)旋松棉塞。3)右手拿接種針在火焰上將針端灼燒滅菌，接著把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌；4)用右手的小指和手掌邊拔出棉塞。接種針先在培養(yǎng)基部分冷卻再用接種針的針尖沾取少量菌種。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 5)接種有兩種手持操作法。一種是水平法，它類似于斜面接種法。一種則稱垂直法，如圖48所示。盡管穿刺時手持方法不同，但穿刺時所用接種針都必須挺直，將接種針自培養(yǎng)基中心垂直地刺入培養(yǎng)基中。穿刺時要

24、做到手穩(wěn)、動作輕巧快速，并且要將接種針穿刺到接近試管的底部，然后沿著接種線將針拔出。最后，塞上棉塞，再將接種針上殘留的菌在火焰上燒掉。(6)將接種過的試管直立于試管架上，放在37或28恒溫箱中培養(yǎng)。24h后觀察結(jié)果(注意：若具有運動能力的細菌，它能沿著接種線向外運動而彌散，故形成的穿刺線較粗而散、反之則細而密)。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖圖47斜面劃線法（斜面劃線法（a）和不同細菌直線接種長出的菌苔形態(tài)）和不同細菌直線接種長出的菌苔形態(tài)（b） 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 圖48 穿刺接種：（a）水平穿刺接種；（b）垂直穿刺接種 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、實驗

25、報告四、實驗報告列表比較各種接種方法及注意事項。列表比較各種接種方法及注意事項。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五、問題和討論五、問題和討論1.斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？2. 穿刺接種時能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗三實驗三熒光原位雜交法檢測活性污泥中的硝化細菌熒光原位雜交法檢測活性污泥中的硝化細菌Detection of Nitrifying Bacteria With Fluorescence In Situ Hybridization 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康膎1、通過本次

26、實驗掌握熒光原位雜交技術(shù)的、通過本次實驗掌握熒光原位雜交技術(shù)的 原理及操作方法；原理及操作方法；n2、通過本次實驗了解硝化細菌在活性污泥生物膜中的、通過本次實驗了解硝化細菌在活性污泥生物膜中的分布和數(shù)量。分布和數(shù)量。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、實驗原理二、實驗原理n原位定性、定量及相對定位檢測特定核酸序列的技術(shù)。n雜交所用探針最早用位素作標記，后來改用熒光作標記，稱為熒光位雜交（FISH， Fluorescence in situ hybridization ）。 雜交技術(shù)(in situ hybridization)，1969年由Pardue和John等人發(fā)明，是在玻片或纖維膜

27、上以標記的單鏈核酸為探針，與組織或細胞中的特定DNA序列進行雜，通過標記信號的有無及強弱來定性、定量及相對定位檢測特定核酸序列的技術(shù)。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 n硝化細菌有亞硝酸細菌和硝酸細菌。n亞硝酸細菌的探針：NSO190，5-CGATCCCTGCTTTTCTCC -3 FAM 標記（綠色）。n硝酸細菌的探針：NIT3 5-CCTGTGCTCCATGCTCCG- 3nHEX標記（藍色）。n竟?fàn)幮蕴结槪篊NT3 5-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3 海南大學(xué)環(huán)境與植

28、物保護學(xué)院 譚志瓊 三、主要實驗材料三、主要實驗材料 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 主要試劑主要試劑探針、1%稀鹽酸、雙蒸水、丙酮、2%硅烷丙酮、明膠、明礬、PBS，4%多聚甲醛、NaOH，50%、60%、70%、80%及96%的乙醇，熒光素HAM、HEX、雜交液。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、操作步驟四、操作步驟n1.玻片預(yù)處理n （1）、一般處理 熱肥皂水洗 自來水沖洗12-15次 蒸餾水沖3次 1%鹽酸中浸泡24h 雙蒸水沖3次 121度滅菌20分鐘。n（2）硅化處理 70%乙醇洗1分鐘 丙酮浸泡1分鐘 2%硅烷丙酮浸泡10S 丙酮浸泡10S 蒸餾水浸泡10S 雙蒸水沖

29、3次 50烘干n2.樣品預(yù)處理 涂片：活性污泥生物膜樣品直接涂布于硅化處理后的玻片上。 熱固定：50 烘2h。 脫水：固定后樣品于50%、60%、70%、80%及96%的乙醇脫中室 脫水3min。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 n3.雜交反應(yīng) 原位雜交反應(yīng)：10uL探針+90uL雜交液，混勻后取5-10uL加到預(yù)處理過的樣品上，暗盒中46雜交2-3h。 探針的清洗：取出玻片，放入50mL探針清洗液，48 浸泡20min。雙蒸水室溫下漂洗2-3次?？諝庵酗L(fēng)干。n4.鏡檢：用熒光顯微鏡觀察，采用藍色和綠色濾光片。拍照。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五五.實驗的注意事項實驗的注意事項n

30、1.嚴格處理玻片：玻片的預(yù)處理應(yīng)嚴格按操作步驟來做，避免有殘留的核酸。n2.設(shè)對照：將實驗室富集培養(yǎng)的硝化細菌經(jīng)過充分分散，稀釋1000倍，取樣50ul，與亞硝化細菌探針雜交。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 六、思考題六、思考題n1.熒光原位雜交的原理是什么？n2.進行本實驗要注意哪些事項？ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 附錄一.雜交液的配制探針雜交液去離子甲酰胺/%SDS/ %Tris-HCI，PH7.2/mol/LNaCI/mol/LISO190550.01200.9NIT3400.01200.9CNIT3400.01200.9 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 附錄二.探針

31、清洗液配制 20mmol/L Tris HCI(PH7.2),0.01%SDS,5mmol/L EDTA,40mmol/LNaCI,56mmol/L探針溶液（ NIT3探針） 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗四實驗四水中大腸菌群(Coliform group)細菌的檢測 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一、實驗?zāi)康?了解大腸菌群的檢測方法。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、材料與器皿()培養(yǎng)基1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨 10g牛肉膏 3g乳糖 5g氯化鈉 5g1.6溴甲酚紫乙醇液 1.0mL蒸餾水 1000mLpH 7.27.4 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 將蛋

32、白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115滅菌20min。 2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 3、品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供平板分離用） 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 3.5g 瓊脂 1520g 蒸餾水 1000mL 無水亞硫酸鈉 5g左右 5的堿性品紅乙醇溶液 20mL pH 7.27.4 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 4、伊紅美

33、藍培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用，3和4可任選一種）蛋白胨 10g乳糖 10gK2HPO4 2.0g瓊脂 20g蒸餾水 1000mL2伊紅（曙紅）水溶液 20mL5美藍（亞甲藍）水溶液 13mL pH 7.27.4 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 (二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養(yǎng)皿。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 三、方法與步驟(一)水樣的采集 供細菌學(xué)檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應(yīng)超過4小時，在04下保存不應(yīng)超過24小時，如不能在4小時內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗報告上注明保

34、存時間和條件。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （1）自來水取樣：應(yīng)在水龍頭打開放水5分鐘，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后，瓶內(nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗項目聯(lián)合取樣，細菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （二）初發(fā)酵試驗 水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10

35、-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （2）接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基（接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡）中各加入水樣10mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL， 小心混勻放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。此即5管法。 （3） 結(jié)果觀察：37中培養(yǎng)24h后取出觀察，觀察有無氣體（杜漢氏小管內(nèi)有無氣體）和酸產(chǎn)生（培養(yǎng)基有無變色）。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反應(yīng)。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保

36、護學(xué)院 譚志瓊 若實驗所測定的15支管中均為陽性反應(yīng)，說明濃水樣污染嚴重，可將樣品進一步稀釋后，再按上述方法接種、培養(yǎng)和觀察。 (三)平板培養(yǎng)試驗 將初發(fā)酵實驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項： 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （1）劃線間距至少相隔0.5厘米；（2）接種釘尖端要稍彎；（3）先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣；（4）劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37培養(yǎng)1824h。 24h后，觀察

37、在平板上出現(xiàn)的單個菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認了大腸菌群細菌的存在 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 (四)復(fù)發(fā)酵驗證實驗 經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37培養(yǎng)24h，陽性反應(yīng)者即確認為大腸菌群細菌。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 四、結(jié)果計算在初發(fā)酵試驗中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細菌混在陽性可疑反應(yīng)管中，通過對初發(fā)酵中的陽性可疑管進行平板和復(fù)

38、發(fā)酵試驗，并進行革蘭氏染色和細菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時只能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應(yīng)管。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表42求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)（MPN）。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經(jīng)下面的換算式計算。 目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN10。10mLMPNMPN（）指數(shù)接種量最大的一管的水樣量（mL） 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 表表42水樣的總大腸菌群檢索表水樣的總大腸菌群檢索表出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每

39、每100ml中的細菌的中的細菌的MPN出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每每100ml中的細菌的中的細菌的MPN10ml管管中中1ml管管中中0.1ml管管中中10ml管管中中1ml管管中中0.1ml管管中中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 五、實驗報告1、 簡述實驗過程

40、。2、計算實驗結(jié)果。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 六、問題與思考實驗過程中有什么問題，你認為原因何在，如何克服？ 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 實驗五實驗五土壤及空氣中微生物的檢測土壤及空氣中微生物的檢測 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 一.試驗?zāi)康?. 學(xué)會土壤微生物的檢測方法，了解土壤中微生物的數(shù)和組成。 2. 了解一定環(huán)境空氣中微生物的分布情況，學(xué)習(xí)并掌握檢定和計數(shù)空氣微生物的基本方法。 (注:每組兩人) 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 二、材料和儀器 ()培養(yǎng)基1.肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌）2.高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）3.查氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)霉菌） (二

41、)滅菌稀釋水、滅菌吸管、滅菌培養(yǎng)皿。 (三)土壤樣品、天平、稱重紙。（四）恒溫箱、氣體流量計 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 三、方法和步驟（一）土壤微生物檢測(1)土壤樣品的連續(xù)稀釋 取新鮮土壤樣品1g，在酒精燈火焰旁加到一個裝有99mL無菌水的錐形瓶中（錐形瓶內(nèi)裝有幾個玻璃珠），將錐形瓶依左右方向振蕩數(shù)十次使土與水充分混合，將菌分散，即為10-2mL菌液。然后將菌懸液進一步稀釋。一直稀釋到合適的稀釋倍數(shù)（使接種1mL菌液的培養(yǎng)皿平板上出現(xiàn)30300個菌落。(2)根據(jù)樣品中各種微生物的數(shù)量選擇合適的稀釋度，每種選擇三個稀釋度，每個稀釋度設(shè)兩個重復(fù)。 選擇出合適的稀釋度后，用移液管將懸液1mL轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院 譚志瓊 （3）