細(xì)胞破碎PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 細(xì)胞壁是微生物菌體比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不僅取決于微細(xì)胞壁是微生物菌體比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不僅取決于微生物的類(lèi)型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細(xì)胞所處的生生物的類(lèi)型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細(xì)胞所處的生長(zhǎng)階段、細(xì)胞的存儲(chǔ)方式以及其它一些因素。不同微生物長(zhǎng)階段、細(xì)胞的存儲(chǔ)方式以及其它一些因素。不同微生物菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有一定差異。菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有一定差異。 一、細(xì)菌一、細(xì)菌 細(xì)菌的細(xì)胞壁堅(jiān)韌而有彈性，由不同的肽鏈結(jié)合組成細(xì)菌的細(xì)胞壁堅(jiān)韌而有彈性，由不同的肽鏈結(jié)合組成質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其厚度因細(xì)菌不同而有差異，可抵質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其厚度因細(xì)菌不同而有差異，可抵御外界的機(jī)械損傷，并可承受細(xì)胞

2、內(nèi)強(qiáng)大的滲透壓而不被御外界的機(jī)械損傷，并可承受細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)大的滲透壓而不被破壞。破壞。 第1頁(yè)/共34頁(yè) 細(xì)胞壁的主要成份是肽聚糖，由細(xì)胞壁的主要成份是肽聚糖，由N N乙酰葡糖胺（見(jiàn)圖乙酰葡糖胺（見(jiàn)圖2-12-1a a）和和N N乙酰胞壁酸（見(jiàn)圖乙酰胞壁酸（見(jiàn)圖2-12-1b b）構(gòu)成雙糖單元，以構(gòu)成雙糖單元，以（1-41-4）糖苷鍵連接成大分子。糖苷鍵連接成大分子。N N乙酰胞壁酸分子上四肽乙酰胞壁酸分子上四肽側(cè)鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過(guò)肽橋或肽鍵連接起側(cè)鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過(guò)肽橋或肽鍵連接起來(lái)，組成機(jī)械性很強(qiáng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，像膠合板一樣，粘合成來(lái)，組成機(jī)械性很強(qiáng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，像膠合板

3、一樣，粘合成多層。各種細(xì)菌細(xì)胞壁酞聚糖結(jié)構(gòu)均相同，但在四肽側(cè)鏈多層。各種細(xì)菌細(xì)胞壁酞聚糖結(jié)構(gòu)均相同，但在四肽側(cè)鏈的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。 革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁（見(jiàn)圖革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁（見(jiàn)圖2-22-2）較厚，約）較厚，約20208080nmnm。含含15155050層肽聚糖片層，每層厚度層肽聚糖片層，每層厚度1 1nmnm，約占細(xì)胞干重的約占細(xì)胞干重的50%50%80%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。 第2頁(yè)/共34頁(yè) 圖圖2-1 細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組分細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組分 第3頁(yè)/共34頁(yè) 革蘭氏陰性菌細(xì)

4、胞壁（見(jiàn)圖革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁（見(jiàn)圖2-32-3）細(xì)胞壁較薄，有）細(xì)胞壁較薄，有1 12 2層肽聚糖片，在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多層肽聚糖片，在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類(lèi)糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)上非常重要，如果被抽提，細(xì)和蛋白質(zhì)等在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)上非常重要，如果被抽提，細(xì)胞壁將變得很不牢固。胞壁將變得很不牢固。 第4頁(yè)/共34頁(yè) 二、真菌和酵母二、真菌和酵母 真菌的細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)（真菌的細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)（N-N-乙酰葡萄糖胺的一種聚乙酰葡萄糖胺的一種聚合物）纖維素、葡聚糖、甘

5、露聚糖、半乳聚糖等。此外還合物）纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外還有蛋白質(zhì)、類(lèi)脂、無(wú)機(jī)鹽等。而酵母的細(xì)胞壁（見(jiàn)圖有蛋白質(zhì)、類(lèi)脂、無(wú)機(jī)鹽等。而酵母的細(xì)胞壁（見(jiàn)圖2-42-4）由特殊的纖絲狀物質(zhì)構(gòu)成，主要成份是甘露聚糖（由特殊的纖絲狀物質(zhì)構(gòu)成，主要成份是甘露聚糖（31%31%），），葡聚糖（葡聚糖（29%29%），蛋白質(zhì)（），蛋白質(zhì)（13%13%）和類(lèi)脂質(zhì)（）和類(lèi)脂質(zhì)（8.5%8.5%）。酵母）。酵母中的葡聚糖的為中的葡聚糖的為 -1-1，6-6-葡聚糖通過(guò)葡聚糖通過(guò)-1-1，3 3鍵與鍵與D-D-葡萄糖葡萄糖中第一側(cè)鏈交連而不溶于水。中第一側(cè)鏈交連而不溶于水。 所有的真菌細(xì)胞壁是由不同

6、的多糖鏈相互纏繞成一股所有的真菌細(xì)胞壁是由不同的多糖鏈相互纏繞成一股又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質(zhì)及類(lèi)脂和一些小分子的多糖又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質(zhì)及類(lèi)脂和一些小分子的多糖基質(zhì)中，看起來(lái)像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細(xì)胞壁的基質(zhì)中，看起來(lái)像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和硬度。機(jī)械強(qiáng)度和硬度。第5頁(yè)/共34頁(yè) 三、藻類(lèi)三、藻類(lèi) 藻類(lèi)的細(xì)胞壁更為復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)成份，是纖絲狀藻類(lèi)的細(xì)胞壁更為復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)成份，是纖絲狀的多糖類(lèi)物質(zhì)。的多糖類(lèi)物質(zhì)。 M-甘露聚糠；P-磷酸二脂鍵；G-葡聚糠 圖2-4 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖 第6頁(yè)/共34頁(yè) 細(xì)胞破碎的方法很多，在諸多破碎方法中，機(jī)械法中細(xì)

7、胞破碎的方法很多，在諸多破碎方法中，機(jī)械法中的球磨機(jī)和高壓勻漿機(jī)不僅在實(shí)驗(yàn)室而且在工業(yè)得到應(yīng)用的球磨機(jī)和高壓勻漿機(jī)不僅在實(shí)驗(yàn)室而且在工業(yè)得到應(yīng)用。其它的方法大多尚停留在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，工業(yè)化的應(yīng)用還。其它的方法大多尚停留在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，工業(yè)化的應(yīng)用還在探索之中。在探索之中。 一、球磨法一、球磨法 球磨機(jī)是破碎微生物細(xì)胞的常用設(shè)備，一般有立式（球磨機(jī)是破碎微生物細(xì)胞的常用設(shè)備，一般有立式（見(jiàn)圖見(jiàn)圖2-52-5）或臥式（見(jiàn)圖）或臥式（見(jiàn)圖2-62-6）兩種，在磨腔中裝入小玻璃）兩種，在磨腔中裝入小玻璃球或小鋼球，由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)攪拌碟片高速攪拌微生物細(xì)胞球或小鋼球，由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)攪拌碟片高速攪拌微生物細(xì)胞懸浮

8、物和小磨球而產(chǎn)生剪切力，將細(xì)胞破碎。懸浮物和小磨球而產(chǎn)生剪切力，將細(xì)胞破碎。第7頁(yè)/共34頁(yè) 圖2-5 Netzsch Molinex KE5攪拌磨 圖2-6 Netzsh LM20砂磨機(jī)第8頁(yè)/共34頁(yè)破碎作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律： （2-1） 式中 Rt時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）； Rm100%破碎細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）。 k破碎的比速率，s-1； t球磨機(jī)工作的時(shí)間，s。()mdRk RRdt第9頁(yè)/共34頁(yè) 將上式由開(kāi)始工作到t時(shí)刻積分，可得： 00RtdRktRmR1lnln()1mmRktRRx（2-2）式中 x為R/Rm，t時(shí)刻釋放蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)，x數(shù)值越大，表示破

9、碎程度越高。 一般用破碎率一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定義為被破表示破碎程度。破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。 第10頁(yè)/共34頁(yè)式中 N0原始細(xì)胞數(shù)量； N經(jīng)t時(shí)刻操作后保留下來(lái)的未受損害完整細(xì)胞的數(shù)量。N0和N可由直接計(jì)數(shù)法和間接法求得。直接計(jì)數(shù)法是直接對(duì)稀釋后的樣品用血球計(jì)數(shù)器或平板菌落直接計(jì)數(shù)法是直接對(duì)稀釋后的樣品用血球計(jì)數(shù)器或平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。 間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去細(xì)胞碎片，未破碎的細(xì)胞及其他懸浮物，然后對(duì)清液進(jìn)行蛋細(xì)胞碎片，未破碎的

10、細(xì)胞及其他懸浮物，然后對(duì)清液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量或酶的活性進(jìn)行分析。通過(guò)細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物白質(zhì)含量或酶的活性進(jìn)行分析。通過(guò)細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量的量R與所有細(xì)胞理論最大釋放量與所有細(xì)胞理論最大釋放量Rm的比值的比值R/Rm，求出破碎求出破碎率。率。 00%()100%YNNN （2-3）第11頁(yè)/共34頁(yè) 破碎率是選擇細(xì)胞破碎設(shè)備的重要依據(jù)之一。破碎率是選擇細(xì)胞破碎設(shè)備的重要依據(jù)之一。 在用球磨法破碎細(xì)胞的過(guò)程中，影響因素有以下幾個(gè)在用球磨法破碎細(xì)胞的過(guò)程中，影響因素有以下幾個(gè)方面：方面： （1）攪拌器外緣速率）攪拌器外緣速率 攪拌器速度增加，剪切力增大，攪拌器速度增加，剪切力增大，細(xì)胞破碎量增

11、大，但是高的能量消耗，高的熱量產(chǎn)生和磨細(xì)胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的熱量產(chǎn)生和磨球的磨損以及因剪切力引起產(chǎn)物失活，因此對(duì)于給定處理球的磨損以及因剪切力引起產(chǎn)物失活，因此對(duì)于給定處理量和對(duì)蛋白質(zhì)的釋放要求下，存在著最佳效率點(diǎn)。實(shí)際生量和對(duì)蛋白質(zhì)的釋放要求下，存在著最佳效率點(diǎn)。實(shí)際生產(chǎn)中，攪拌器外緣速率控制在（產(chǎn)中，攪拌器外緣速率控制在（515）m/s之間。之間。第12頁(yè)/共34頁(yè) （2）細(xì)胞的濃度）細(xì)胞的濃度 在細(xì)胞破碎過(guò)程中，產(chǎn)生的熱量隨濃在細(xì)胞破碎過(guò)程中，產(chǎn)生的熱量隨濃度的增大而提高，增加了冷卻的費(fèi)用。因此最佳的細(xì)胞濃度的增大而提高，增加了冷卻的費(fèi)用。因此最佳的細(xì)胞濃度由實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

12、用度由實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或細(xì)菌時(shí)研磨和破碎酵母或細(xì)菌時(shí)，細(xì)胞濃度控制在，細(xì)胞濃度控制在40%左右。左右。 （3）球粒大小和裝填量）球粒大小和裝填量 磨球越小，細(xì)胞破碎速度越快磨球越小，細(xì)胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實(shí)驗(yàn)室規(guī)。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研磨機(jī)中，球徑為模的研磨機(jī)中，球徑為0.2mm較好；而工業(yè)化規(guī)模操作中，較好；而工業(yè)化規(guī)模操作中，球徑球徑 0.4mm。且不同的細(xì)胞，應(yīng)選擇不同的球徑。球粒的且不同的細(xì)胞，應(yīng)選擇不同的球徑。球粒的體積占研磨機(jī)腔體自由體積的百分比同樣影響破碎效果，體積占研磨機(jī)腔體自由

13、體積的百分比同樣影響破碎效果，一般控制在一般控制在80%90%之間，并隨球粒直徑大小而變化。之間，并隨球粒直徑大小而變化。 第13頁(yè)/共34頁(yè) （4 4）溫度）溫度 操作溫度控制在操作溫度控制在554040范圍內(nèi)對(duì)破碎范圍內(nèi)對(duì)破碎物影響不大。但在研磨過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量積累，為控制物影響不大。但在研磨過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量積累，為控制磨室溫度，在攪拌器和磨室外筒分別設(shè)計(jì)有冷卻夾套，磨室溫度，在攪拌器和磨室外筒分別設(shè)計(jì)有冷卻夾套，通過(guò)冷卻劑來(lái)調(diào)節(jié)磨室的溫度。通過(guò)冷卻劑來(lái)調(diào)節(jié)磨室的溫度。 （5 5）流量）流量 高流量有利于降低能耗、降低細(xì)胞的破高流量有利于降低能耗、降低細(xì)胞的破碎程度和釋放蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。碎程

14、度和釋放蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。 （6 6）微生物特性）微生物特性 一般來(lái)說(shuō)酵母比細(xì)菌細(xì)胞處理效一般來(lái)說(shuō)酵母比細(xì)菌細(xì)胞處理效果好。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞僅為酵母細(xì)胞的十分之一，而且細(xì)果好。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞僅為酵母細(xì)胞的十分之一，而且細(xì)菌細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度比酵母要高。一臺(tái)菌細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度比酵母要高。一臺(tái)2020L L球磨機(jī)在最適條球磨機(jī)在最適條件下，每小時(shí)可加工件下，每小時(shí)可加工200200kgkg面包酵母，而在同樣條件下，面包酵母，而在同樣條件下，處理細(xì)菌細(xì)胞僅為處理細(xì)菌細(xì)胞僅為10102020kgkg。 第14頁(yè)/共34頁(yè) 二、高壓勻漿法二、高壓勻漿法 高壓勻漿法是液體剪切破碎方法中的一種。它的主要高壓勻漿法是液體剪切

15、破碎方法中的一種。它的主要設(shè)備是高壓勻漿機(jī)，它有一個(gè)高壓位移泵和一個(gè)可調(diào)節(jié)設(shè)備是高壓勻漿機(jī)，它有一個(gè)高壓位移泵和一個(gè)可調(diào)節(jié)進(jìn)料速度的針形閥（見(jiàn)圖進(jìn)料速度的針形閥（見(jiàn)圖2-72-7）。當(dāng)菌體懸浮液經(jīng)過(guò)高壓）。當(dāng)菌體懸浮液經(jīng)過(guò)高壓泵加壓后，通過(guò)閥芯與閥座之間的通道時(shí)，懸浮液突然泵加壓后，通過(guò)閥芯與閥座之間的通道時(shí)，懸浮液突然改變方向，向球撞擊。在通過(guò)閥門(mén)時(shí)產(chǎn)生高剪應(yīng)力，向改變方向，向球撞擊。在通過(guò)閥門(mén)時(shí)產(chǎn)生高剪應(yīng)力，向環(huán)撞擊時(shí)產(chǎn)生巨大的沖擊力，將細(xì)胞破碎，然后排出。環(huán)撞擊時(shí)產(chǎn)生巨大的沖擊力，將細(xì)胞破碎，然后排出。其破碎率服從一級(jí)反應(yīng)定律。其破碎率服從一級(jí)反應(yīng)定律。 dmnmRlkNPRR （2-4

16、） 第15頁(yè)/共34頁(yè) 式中式中R為蛋白質(zhì)釋放量；為蛋白質(zhì)釋放量；Rm為蛋白質(zhì)最大釋放量；為蛋白質(zhì)最大釋放量；N為懸為懸浮液通過(guò)勻漿器的次數(shù)；浮液通過(guò)勻漿器的次數(shù)；P為操作壓力；為操作壓力；k為與溫度有關(guān)的速為與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；指數(shù)度常數(shù)；指數(shù)d值對(duì)于有機(jī)體是抵抗破碎能力的一種量度，值對(duì)于有機(jī)體是抵抗破碎能力的一種量度，不同的有機(jī)體其值不同，如釀酒酵母不同的有機(jī)體其值不同，如釀酒酵母d=2.9，大腸桿菌大腸桿菌d=2.21。 在高壓勻漿機(jī)操作中，主要影響因素有：在高壓勻漿機(jī)操作中，主要影響因素有： 圖圖2-7 高壓勻漿機(jī)的排出閥裝置圖高壓勻漿機(jī)的排出閥裝置圖 第16頁(yè)/共34頁(yè) （1）溫度

17、 破碎率隨著溫度的升高而增加。當(dāng)懸浮液中酵母濃度（450750）kg/m3，操作溫度由5提高到30時(shí)，破碎率約提高1.5倍。但是高溫破碎只適用于非熱變性產(chǎn)物，如果溫度高于40時(shí)，蛋白質(zhì)在破碎過(guò)程中會(huì)發(fā)生變性。因此，進(jìn)口處用干冰來(lái)調(diào)節(jié)溫度，使出口處的溫度維持在20左右。 （2）壓力 操作壓力的合理選擇非常重要。提高壓力需增加消耗，壓力每升高100Mpa會(huì)多消耗3.5KW能量；壓力每升高10Mpa，溫度將提高2；另外壓力過(guò)高將引起高壓勻漿機(jī)排出閥座劇烈磨損。通常非結(jié)合的酶，操作壓力為5.45107Pa，菌體濃度10%20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），處理一次即可。在操作壓力為55Mpa的條件下，通過(guò)6次勻漿假絲

18、酵母得到30%可利用蛋白質(zhì)。 一般來(lái)講，高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌。一般來(lái)講，高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌。 第17頁(yè)/共34頁(yè) 三、超聲破碎法三、超聲破碎法 超聲破碎法是另一種液相剪切破碎法。其實(shí)驗(yàn)室裝置見(jiàn)圖2-8 。 圖圖2-8 連續(xù)破碎池的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖連續(xù)破碎池的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖 第18頁(yè)/共34頁(yè) 當(dāng)通過(guò)超聲探頭向懸浮液輸入聲能，大量聲能轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度，使細(xì)胞破碎。在超聲波破碎過(guò)程中，蛋白質(zhì)釋放遵循一級(jí)反應(yīng)定律：1exp()xkt （2-5） 式中 x為釋放蛋白質(zhì)的分率； k為蛋白質(zhì)釋放常數(shù),min-1； t為超聲波發(fā)射時(shí)間，min。 蛋白質(zhì)釋放常數(shù)k取決于輸入聲能

19、，由實(shí)驗(yàn)確定。對(duì)于從啤酒酵母懸浮液中(200kg濕重/m3懸浮液)，用190聲瓦的20HZ聲頻的超聲波處理時(shí)： k=b(P-P0)0.9 （2-6） 第19頁(yè)/共34頁(yè) 式中 b為常數(shù)； P為輸入功率，J/(kg.s)； P0為由超聲波引起的空穴的臨界功率，J/(kg.s)。 當(dāng)超聲波聲能通過(guò)探頭向懸浮液傳遞能量，當(dāng)產(chǎn)生的氣泡破裂時(shí)，絕大部分釋放出的能量都以熱的形式為液體吸收，為避免高溫，在破碎池中設(shè)計(jì)了冷卻水夾套，并在開(kāi)始時(shí)先把懸浮液冷卻至05，并不斷將冷卻液連續(xù)通過(guò)夾套，短期的聲波破碎與短期的冷卻交替進(jìn)行操作，以防止高溫使蛋白質(zhì)變性。 為提高破碎效率，在破碎池中可添加細(xì)小的球粒（可以是鋼制

20、的或玻璃的），以產(chǎn)生“研磨”效應(yīng)，提高細(xì)胞破碎率。 超聲波破碎是實(shí)驗(yàn)室常用的一種普通方法，由于向大超聲波破碎是實(shí)驗(yàn)室常用的一種普通方法，由于向大量的懸浮液中輸入足夠的能量有一定的困難，因此在工業(yè)量的懸浮液中輸入足夠的能量有一定的困難，因此在工業(yè)還未采用。還未采用。第20頁(yè)/共34頁(yè) 四、酶溶法四、酶溶法 酶溶法是利用細(xì)胞壁水解酶使細(xì)胞壁溶解，釋放出胞內(nèi)酶溶法是利用細(xì)胞壁水解酶使細(xì)胞壁溶解，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)的方法。根據(jù)菌體不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)選用特定的溶解物質(zhì)的方法。根據(jù)菌體不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)選用特定的溶解酶。酶。 細(xì)胞壁溶解酶有內(nèi)細(xì)胞壁溶解酶有內(nèi)-N-乙酰壁酰胺酶和內(nèi)乙酰壁酰胺酶和內(nèi)-N-乙酰氨基葡乙

21、酰氨基葡萄糖苷酶，水解萄糖苷酶，水解N-乙酰壁酸與乙酰壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的乙酰氨基葡萄糖之間的-1,4鍵；鍵；N-乙酰壁酸乙酰壁酸-L-丙氨酸酰胺酶系切開(kāi)肽聚糖與肽之丙氨酸酰胺酶系切開(kāi)肽聚糖與肽之間結(jié)合點(diǎn)的酶，又稱(chēng)自溶素，在微生物細(xì)胞的自溶上起著間結(jié)合點(diǎn)的酶，又稱(chēng)自溶素，在微生物細(xì)胞的自溶上起著重要的作用。酞酶切開(kāi)肽聚糖中肽段部分的肽鍵，單獨(dú)存重要的作用。酞酶切開(kāi)肽聚糖中肽段部分的肽鍵，單獨(dú)存在時(shí)有一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存時(shí)有明顯可在時(shí)有一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存時(shí)有明顯可促進(jìn)真菌細(xì)胞壁的溶解。針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成，促進(jìn)真菌細(xì)胞壁的溶解。針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和

22、組成，使用酶溶解細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，通常選用兩種以上的酶協(xié)同作使用酶溶解細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，通常選用兩種以上的酶協(xié)同作用，使溶解作用增強(qiáng)。用，使溶解作用增強(qiáng)。 第21頁(yè)/共34頁(yè) 酵母細(xì)胞壁溶解酶主要成份是酵母細(xì)胞壁溶解酶主要成份是-1,3葡聚糖酶，當(dāng)它與葡聚糖酶，當(dāng)它與磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同時(shí)作用時(shí)，對(duì)溶解酵母的作用磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同時(shí)作用時(shí)，對(duì)溶解酵母的作用顯著增強(qiáng)。而顯著增強(qiáng)。而-1,3葡聚糖酶與甲殼質(zhì)酶協(xié)同作用時(shí)可溶解葡聚糖酶與甲殼質(zhì)酶協(xié)同作用時(shí)可溶解由甲殼質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的霉菌細(xì)胞壁。由甲殼質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的霉菌細(xì)胞壁。 酶溶法的優(yōu)點(diǎn)有：對(duì)設(shè)備的要求低，能耗??；抽酶溶法的優(yōu)點(diǎn)有：對(duì)設(shè)備的要求

23、低，能耗??；抽提的速率和收率高；產(chǎn)品的完整性好；對(duì)提的速率和收率高；產(chǎn)品的完整性好；對(duì)pH值和溫值和溫度等外界條件要求低；由于細(xì)胞壁被溶解，不殘留碎片度等外界條件要求低；由于細(xì)胞壁被溶解，不殘留碎片，有利于提純。但是酶溶法受酶的費(fèi)用限制。，有利于提純。但是酶溶法受酶的費(fèi)用限制。 第22頁(yè)/共34頁(yè) 五、化學(xué)滲透法五、化學(xué)滲透法 用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分的方用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分的方法稱(chēng)為化學(xué)滲透法。例如在發(fā)酵液中添加酸堿、脂溶性有機(jī)法稱(chēng)為化學(xué)滲透法。例如在發(fā)酵液中添加酸堿、脂溶性有機(jī)溶劑（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）和某些表面活性劑，改溶劑（甲苯、丁醇、

24、丙酮、氯仿等）和某些表面活性劑，改變菌體細(xì)胞壁或膜的通透性，使細(xì)胞壁破裂，使胞內(nèi)物質(zhì)釋變菌體細(xì)胞壁或膜的通透性，使細(xì)胞壁破裂，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。放出來(lái)。 酸堿用來(lái)調(diào)節(jié)溶液的酸堿用來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變細(xì)胞所處的環(huán)境，從而值，改變細(xì)胞所處的環(huán)境，從而改變兩性產(chǎn)物蛋白質(zhì)的電荷改變兩性產(chǎn)物蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的作用力降低而溶解到液相中去，或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的作用力降低而溶解到液相中去，便于后面的提取。便于后面的提取。 有機(jī)溶劑被細(xì)胞壁吸收后，會(huì)使細(xì)胞壁膨脹或溶解，導(dǎo)有機(jī)溶劑被細(xì)胞壁吸收后，會(huì)使細(xì)胞壁膨脹或溶解，導(dǎo)致破裂，把胞內(nèi)

25、產(chǎn)物釋放到水相中去。選用溶劑的基本原則致破裂，把胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到水相中去。選用溶劑的基本原則是與細(xì)胞壁中脂質(zhì)類(lèi)似的溶解度參數(shù)的溶劑作為細(xì)胞破碎的是與細(xì)胞壁中脂質(zhì)類(lèi)似的溶解度參數(shù)的溶劑作為細(xì)胞破碎的溶劑溶劑。 第23頁(yè)/共34頁(yè) 表面活性劑是指不僅能溶于水或其他有機(jī)溶劑，同時(shí)又能在相界表面活性劑是指不僅能溶于水或其他有機(jī)溶劑，同時(shí)又能在相界面上定向并改變界面的性質(zhì)的某些有機(jī)化合物。表面活性劑分子中間面上定向并改變界面的性質(zhì)的某些有機(jī)化合物。表面活性劑分子中間同時(shí)具有憎水基團(tuán)和親水基團(tuán)，當(dāng)表面活性劑溶質(zhì)或溶劑中的濃度達(dá)同時(shí)具有憎水基團(tuán)和親水基團(tuán)，當(dāng)表面活性劑溶質(zhì)或溶劑中的濃度達(dá)到一定時(shí)，它的分子會(huì)產(chǎn)

26、生聚集生成膠束，憎水端向內(nèi)，親水端向外到一定時(shí)，它的分子會(huì)產(chǎn)生聚集生成膠束，憎水端向內(nèi)，親水端向外。憎水基團(tuán)聚集在膠束內(nèi)部將溶解的脂蛋白包在中心，而親水基團(tuán)則。憎水基團(tuán)聚集在膠束內(nèi)部將溶解的脂蛋白包在中心，而親水基團(tuán)則向外層，使膜的通透性改變或使細(xì)胞壁溶解，從而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到向外層，使膜的通透性改變或使細(xì)胞壁溶解，從而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到水相中。此法特別適用于膜結(jié)合蛋白酶的溶解。表面活性劑按分子結(jié)水相中。此法特別適用于膜結(jié)合蛋白酶的溶解。表面活性劑按分子結(jié)構(gòu)中帶電性的特征可分為：陰離子型（如直鏈烷基苯磺酸鹽），親水構(gòu)中帶電性的特征可分為：陰離子型（如直鏈烷基苯磺酸鹽），親水基團(tuán)帶有負(fù)電荷；非離子

27、型，如碳原子數(shù)在基團(tuán)帶有負(fù)電荷；非離子型，如碳原子數(shù)在12以上的高碳脂肪醇，在以上的高碳脂肪醇，在分子中沒(méi)有帶電荷的基團(tuán)，其水溶性來(lái)自于分子中所具有的聚氧乙烯分子中沒(méi)有帶電荷的基團(tuán)，其水溶性來(lái)自于分子中所具有的聚氧乙烯醚基和端點(diǎn)羥基；陽(yáng)離子表面活性劑，親水基團(tuán)帶有正電荷；兩性表醚基和端點(diǎn)羥基；陽(yáng)離子表面活性劑，親水基團(tuán)帶有正電荷；兩性表面活性劑，在水中同時(shí)具有可溶于水中的正電性和負(fù)電性基團(tuán)。一般面活性劑，在水中同時(shí)具有可溶于水中的正電性和負(fù)電性基團(tuán)。一般來(lái)說(shuō)，使用離子型表面活性劑比非離子型提取效果要好一些。來(lái)說(shuō)，使用離子型表面活性劑比非離子型提取效果要好一些。第24頁(yè)/共34頁(yè) 六、其它方法六

28、、其它方法 除上述各種方法外，常用的方法還有以下幾種。除上述各種方法外，常用的方法還有以下幾種。 （1）反復(fù)凍融法）反復(fù)凍融法 將待破碎細(xì)胞在將待破碎細(xì)胞在15至至20條件條件下冷凍，然后在室溫下融化，冷凍時(shí)膜的疏水鍵被破碎而下冷凍，然后在室溫下融化，冷凍時(shí)膜的疏水鍵被破碎而疏水性增強(qiáng)，胞內(nèi)水形成冰晶粒而使細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度加大疏水性增強(qiáng)，胞內(nèi)水形成冰晶粒而使細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度加大，反復(fù)凍融多次，使細(xì)胞破裂將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。，反復(fù)凍融多次，使細(xì)胞破裂將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。 （2）干燥法）干燥法 將待破碎細(xì)胞用不同方法進(jìn)行干燥，菌體將待破碎細(xì)胞用不同方法進(jìn)行干燥，菌體細(xì)胞失水，細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度增大，細(xì)胞滲

29、透性發(fā)生變化，細(xì)胞失水，細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度增大，細(xì)胞滲透性發(fā)生變化，然后用丙酮，乙醇或緩沖溶液等溶劑抽提胞內(nèi)物質(zhì)。干燥然后用丙酮，乙醇或緩沖溶液等溶劑抽提胞內(nèi)物質(zhì)。干燥的方法有空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥等。對(duì)不穩(wěn)定生的方法有空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥等。對(duì)不穩(wěn)定生化物質(zhì)進(jìn)行干燥時(shí)，常加入半胱胺酸，巰基乙醇和亞硫酸化物質(zhì)進(jìn)行干燥時(shí)，常加入半胱胺酸，巰基乙醇和亞硫酸鈉等還原劑進(jìn)行保護(hù)。鈉等還原劑進(jìn)行保護(hù)。 第25頁(yè)/共34頁(yè) （3 3）滲透壓沖擊法）滲透壓沖擊法 將兩種不同成分或不同濃度的溶將兩種不同成分或不同濃度的溶液，中間用半透膜隔開(kāi)，則兩種溶液因性質(zhì)不同可由一方液，中間用半透膜隔開(kāi)，則兩種溶

30、液因性質(zhì)不同可由一方向另一方滲透，這種現(xiàn)象叫滲透現(xiàn)象，其推動(dòng)力是滲透壓向另一方滲透，這種現(xiàn)象叫滲透現(xiàn)象，其推動(dòng)力是滲透壓。菌體細(xì)胞膜是天然半透膜，把待破碎細(xì)胞經(jīng)一定濃度甘。菌體細(xì)胞膜是天然半透膜，把待破碎細(xì)胞經(jīng)一定濃度甘油或蔗糖溶液處理，在高滲壓溶液中細(xì)胞脫水，細(xì)胞質(zhì)變油或蔗糖溶液處理，在高滲壓溶液中細(xì)胞脫水，細(xì)胞質(zhì)變稠，發(fā)生質(zhì)壁分離。然后轉(zhuǎn)入低滲透壓溶液中或緩沖溶液稠，發(fā)生質(zhì)壁分離。然后轉(zhuǎn)入低滲透壓溶液中或緩沖溶液中，細(xì)胞快速吸水膨脹而破裂，使胞內(nèi)物釋放到溶液中。中，細(xì)胞快速吸水膨脹而破裂，使胞內(nèi)物釋放到溶液中。用此法處理大腸桿菌時(shí)，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脫用此法處理大腸桿菌時(shí)，可使磷酸

31、脂酶、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶等釋放至溶液中。蛋白質(zhì)釋放量一般為菌體氧核糖核酸酶等釋放至溶液中。蛋白質(zhì)釋放量一般為菌體蛋白總量的蛋白總量的4%4%7%7%。但此法對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌不適用。但此法對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌不適用。第26頁(yè)/共34頁(yè) （4 4）冷熱交替法）冷熱交替法 將待破碎細(xì)胞在將待破碎細(xì)胞在9090維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰水維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰水浴使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。從細(xì)菌或病毒浴使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。 無(wú)論是運(yùn)用機(jī)械法還是非機(jī)械法都要既能破壞微生物菌體的細(xì)胞壁無(wú)論

32、是運(yùn)用機(jī)械法還是非機(jī)械法都要既能破壞微生物菌體的細(xì)胞壁，又要得到不發(fā)生變性的蛋白產(chǎn)物。因此，選擇合理的破碎方法非常重，又要得到不發(fā)生變性的蛋白產(chǎn)物。因此，選擇合理的破碎方法非常重要，通常選擇破碎方法遵循以下一般原則：要，通常選擇破碎方法遵循以下一般原則： 提取的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，選用機(jī)械破碎法；提取的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，選用機(jī)械破碎法； 在細(xì)胞膜附近則可用溫和的非機(jī)械法；在細(xì)胞膜附近則可用溫和的非機(jī)械法； 提取的產(chǎn)物與細(xì)胞壁或膜相結(jié)合時(shí)，可采用機(jī)械法和化學(xué)法相結(jié)提取的產(chǎn)物與細(xì)胞壁或膜相結(jié)合時(shí)，可采用機(jī)械法和化學(xué)法相結(jié)合的方法，以促進(jìn)產(chǎn)物溶解度的提高或緩和操作條件；合的方法，以促進(jìn)產(chǎn)物溶解度的提高或緩

33、和操作條件； 為提高破碎率，可采用機(jī)械法和非機(jī)械法相結(jié)合的方法。如面包為提高破碎率，可采用機(jī)械法和非機(jī)械法相結(jié)合的方法。如面包酵母的破碎，可先用細(xì)胞壁溶解酶予處理，然后用高壓勻漿機(jī)在酵母的破碎，可先用細(xì)胞壁溶解酶予處理，然后用高壓勻漿機(jī)在9595MpaMpa壓力下勻漿四次，總破碎率可接近壓力下勻漿四次，總破碎率可接近100%100%，而單獨(dú)用高壓勻漿機(jī)破碎率只，而單獨(dú)用高壓勻漿機(jī)破碎率只有有32%32%。第27頁(yè)/共34頁(yè) 利用利用DNADNA重組技術(shù)，把重組體重組技術(shù)，把重組體DNADNA引入宿主細(xì)胞，使其在引入宿主細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，便可得到一定的蛋白質(zhì)。目前已成功的利用大細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，

34、便可得到一定的蛋白質(zhì)。目前已成功的利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胰島素，人的生長(zhǎng)激素，人胸腺激素腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)胰島素，人的生長(zhǎng)激素，人胸腺激素1 1，、干擾素，牛生長(zhǎng)激素，乙型肝炎病毒抗原和口干擾素，牛生長(zhǎng)激素，乙型肝炎病毒抗原和口啼疫病毒抗原等。外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致啼疫病毒抗原等。外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成。所謂包涵體是指蛋白質(zhì)分子本身及與其周?chē)w的形成。所謂包涵體是指蛋白質(zhì)分子本身及與其周?chē)碾s蛋白、核酸等形成不溶性的，無(wú)活性的聚集體，其中大的雜蛋白、核酸等形成不溶性的，無(wú)活性的聚集體，其中大部分是克隆表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物蛋白。這些目標(biāo)產(chǎn)物蛋白在一級(jí)部分是克隆表達(dá)

35、的目標(biāo)產(chǎn)物蛋白。這些目標(biāo)產(chǎn)物蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上是正確的，但在立體結(jié)構(gòu)上卻是錯(cuò)誤的，因此沒(méi)有生結(jié)構(gòu)上是正確的，但在立體結(jié)構(gòu)上卻是錯(cuò)誤的，因此沒(méi)有生物活性。在利用大腸桿菌生產(chǎn)蛋白的過(guò)程中，重組蛋白大多物活性。在利用大腸桿菌生產(chǎn)蛋白的過(guò)程中，重組蛋白大多數(shù)情況是以包涵體形式存在。要從包涵體中分離出具有生物數(shù)情況是以包涵體形式存在。要從包涵體中分離出具有生物活性的產(chǎn)物，通常的處理步驟為：收集菌體細(xì)胞活性的產(chǎn)物，通常的處理步驟為：收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎離心分離離心分離包涵體的洗滌包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋目標(biāo)蛋白的復(fù)性。白的復(fù)性。第28頁(yè)/共34頁(yè) 一、包涵體的形成、分離

36、及洗滌一、包涵體的形成、分離及洗滌 形成包涵體的因素主要有以下幾個(gè)方面：形成包涵體的因素主要有以下幾個(gè)方面： 重組蛋白的表達(dá)率過(guò)高，超過(guò)了細(xì)菌的正常代謝，由于細(xì)菌的蛋重組蛋白的表達(dá)率過(guò)高，超過(guò)了細(xì)菌的正常代謝，由于細(xì)菌的蛋白水解能力達(dá)到飽和，導(dǎo)致重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)沉淀下來(lái)；白水解能力達(dá)到飽和，導(dǎo)致重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)沉淀下來(lái)； 由于合成速度太快，以致沒(méi)有足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊，二硫鍵不由于合成速度太快，以致沒(méi)有足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，導(dǎo)致重組蛋白溶解度變?。荒苷_配對(duì)，導(dǎo)致重組蛋白溶解度變小； 與重組蛋白的氨基酸組成有關(guān)，一般說(shuō)含硫氨基酸越高越易形成與重組蛋白的氨基酸組成有關(guān)，一般說(shuō)

37、含硫氨基酸越高越易形成包涵體；包涵體； 重組蛋白是宿主菌的異源蛋白，大量生成后，缺乏后修飾所需酶重組蛋白是宿主菌的異源蛋白，大量生成后，缺乏后修飾所需酶類(lèi)和輔助因子，如折疊酶及分子伴侶等，導(dǎo)致中間體大量積累導(dǎo)致沉淀類(lèi)和輔助因子，如折疊酶及分子伴侶等，導(dǎo)致中間體大量積累導(dǎo)致沉淀； 與重組蛋白的本身的溶解性有關(guān)；與重組蛋白的本身的溶解性有關(guān)； 在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體形成。等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體形成。第29頁(yè)/共34頁(yè) 由于重組蛋白形成包涵體，包涵體又位于細(xì)胞質(zhì)中，因由于重組蛋白形成包涵體，包

38、涵體又位于細(xì)胞質(zhì)中，因此可選擇破碎細(xì)胞的方法，得到包涵體。例如人此可選擇破碎細(xì)胞的方法，得到包涵體。例如人干擾素干擾素的提取中，先把發(fā)酵液冷卻至的提取中，先把發(fā)酵液冷卻至1010以下，離心（以下，離心（40004000r/minr/min）分離，除去上層清液，得到菌體，將細(xì)胞懸浮于分離，除去上層清液，得到菌體，將細(xì)胞懸浮于1010倍體積倍體積PBSPBS緩沖溶液中，于冰浴下進(jìn)行超聲破碎，反復(fù)緩沖溶液中，于冰浴下進(jìn)行超聲破碎，反復(fù)5 5次，每次次，每次5 5s s，離心（離心（40004000r/minr/min）分離后，用分離后，用0.1%0.1%TritonX-100TritonX-100的

39、溶液的溶液充 分 攪 拌 均 勻 ， 進(jìn) 行 洗 滌 。 洗 滌 三 次 后 ， 離 心 （充 分 攪 拌 均 勻 ， 進(jìn) 行 洗 滌 。 洗 滌 三 次 后 ， 離 心 （1000010000r/min20r/min20分鐘），可得到包涵體。細(xì)胞破碎后離心分分鐘），可得到包涵體。細(xì)胞破碎后離心分離的包涵體沉淀物中，除目標(biāo)蛋白質(zhì)外，還有其他蛋白質(zhì)、離的包涵體沉淀物中，除目標(biāo)蛋白質(zhì)外，還有其他蛋白質(zhì)、核酸等的存在，經(jīng)過(guò)洗滌，可以除去吸附在包涵體表面的不核酸等的存在，經(jīng)過(guò)洗滌，可以除去吸附在包涵體表面的不溶性雜蛋白、膜碎片等，達(dá)到純化包涵體的目的。洗滌多采溶性雜蛋白、膜碎片等，達(dá)到純化包涵體的目的

40、。洗滌多采用較溫和的表面活性劑（如用較溫和的表面活性劑（如TritonX-100TritonX-100）或低濃度的弱變或低濃度的弱變性劑（如尿素）等。洗滌劑的濃度非常重要，通常不要太高性劑（如尿素）等。洗滌劑的濃度非常重要，通常不要太高，以免包涵體也發(fā)生溶解。，以免包涵體也發(fā)生溶解。第30頁(yè)/共34頁(yè) 二、包涵體的變性溶解二、包涵體的變性溶解 包涵體中不溶性的活性蛋白產(chǎn)物必須溶解到液相中，才包涵體中不溶性的活性蛋白產(chǎn)物必須溶解到液相中，才能采用各種手段使其得到進(jìn)一步純化。一般的水溶液很難將能采用各種手段使其得到進(jìn)一步純化。一般的水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性的方法才能使其形成可溶性的其

41、溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的變性增溶劑有十二烷磺酸鈉（形式。常用的變性增溶劑有十二烷磺酸鈉（SDSSDS）、）、尿素、尿素、有機(jī)溶劑（乙腈、丙酮）、有機(jī)溶劑（乙腈、丙酮）、pHpH9.09.0的堿溶液或鹽酸胍等。的堿溶液或鹽酸胍等。 十二烷基磺酸鈉（十二烷基磺酸鈉（SDSSDS）是曾經(jīng)廣泛使用的變性劑。它是曾經(jīng)廣泛使用的變性劑。它可在低濃度下溶解包涵體，主要是破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水可在低濃度下溶解包涵體，主要是破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。但是結(jié)合在蛋白質(zhì)上的相互作用。但是結(jié)合在蛋白質(zhì)上的SDSSDS分子難以除去。一般分子難以除去。一般SDSSDS的使用濃度為的使用濃度為1%1%2%2%（w/vw/v）。）。 第31頁(yè)/共34頁(yè) 尿素和鹽酸胍可打斷包涵體內(nèi)的化學(xué)鍵和氫鍵。用（尿素和鹽酸胍可打斷包涵體內(nèi)的化學(xué)鍵和氫鍵。用（8 81010）mol/L mol/L 的尿素溶解包涵體，其溶解速度較慢，溶解度為的尿素溶解包涵體，其溶解速度較慢，溶解度為70%70%90%90%。在復(fù)性后除去尿素不會(huì)造成蛋白質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，。在復(fù)性后除去尿素不會(huì)造成蛋白質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還可選用多種層析方法對(duì)提取到的包涵體進(jìn)行純化