DNA復(fù)制基礎(chǔ)知識PPT課件

1、第四章 DNA 復(fù) 制DNA Replication1 引言引言-基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系系2 復(fù)制子復(fù)制子3 DNA復(fù)制的幾種形式復(fù)制的幾種形式4 DNA聚合酶聚合酶5 原核生物原核生物DNA復(fù)制的基本過程復(fù)制的基本過程6 真核生物真核生物DNA復(fù)制復(fù)制7 DNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控8 小小 結(jié)結(jié)第1頁/共71頁 重點(diǎn)內(nèi)容：重點(diǎn)內(nèi)容： 幾個重要概念：幾個重要概念：DNA的復(fù)制、復(fù)制子、復(fù)制眼、的復(fù)制、復(fù)制子、復(fù)制眼、復(fù)制叉、復(fù)制叉、DNA聚合酶、聚合酶、DNA的半保留復(fù)制、的半保留復(fù)制、DNA的半不連續(xù)復(fù)制、的半不連續(xù)復(fù)制、DNA的先導(dǎo)鏈、的先導(dǎo)鏈、DNA的后隨鏈、

2、的后隨鏈、岡崎片段；岡崎片段；不同生物基因組復(fù)制子數(shù)目；不同生物基因組復(fù)制子數(shù)目；線性線性DNA復(fù)制末端問題的提出及解決方案；復(fù)制末端問題的提出及解決方案；-復(fù)制、復(fù)制、滾環(huán)復(fù)制及滾環(huán)復(fù)制及D-環(huán)復(fù)制的機(jī)制；環(huán)復(fù)制的機(jī)制；大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合聚合酶酶 I、II、 III 的性質(zhì)比較，的性質(zhì)比較，DNA聚合酶聚合酶與缺口與缺口平移法制備探針；平移法制備探針；DNA復(fù)制的起始、延伸及終止。復(fù)制的起始、延伸及終止。 了解內(nèi)容：了解內(nèi)容： 基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系；基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系；復(fù)制叉移動復(fù)制叉移動方向的確定；真核生物方向的確定；真核生物DNA聚合酶的種類及各自的聚合酶的種類及各

3、自的功能；功能；DNA復(fù)制的調(diào)控。復(fù)制的調(diào)控。 第2頁/共71頁1 1 引言引言-基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)基因組復(fù)制與細(xì)胞分裂的關(guān)系系 細(xì)胞細(xì)胞在每次分裂的過程中，在每次分裂的過程中，整個基因組都必須精確地復(fù)制一次整個基因組都必須精確地復(fù)制一次。 如何保證這一點(diǎn)？如何保證這一點(diǎn)？兩個原則兩個原則 (1) DNA復(fù)制的啟動決定了細(xì)胞的進(jìn)一步分裂復(fù)制的啟動決定了細(xì)胞的進(jìn)一步分裂; (2) 復(fù)制過程完成前，細(xì)胞是不會發(fā)生分裂的。復(fù)制過程完成前，細(xì)胞是不會發(fā)生分裂的。第3頁/共71頁2 復(fù)制子復(fù)制子(replicon)2.1 復(fù)制子的定義2.2 不同生物復(fù)制子的數(shù)目2.3 復(fù)制眼概念2.4 復(fù)制叉概念

4、及其移動方向的實(shí)驗(yàn)確定2.5 復(fù)制的模式-起點(diǎn)、方向和速度第4頁/共71頁2.1 復(fù)制子的定義DNADNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱為復(fù)制子中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon) (replicon) 。 復(fù)制子是根據(jù)它含有復(fù)制所需的控制元件來定義復(fù)制子是根據(jù)它含有復(fù)制所需的控制元件來定義的，在復(fù)制啟動位點(diǎn)具的，在復(fù)制啟動位點(diǎn)具起始點(diǎn)（起始點(diǎn)（origin)origin)，在復(fù)制，在復(fù)制終止位點(diǎn)具終止位點(diǎn)具終點(diǎn)（終點(diǎn)（terminus)terminus)。起始點(diǎn)僅作用于所。起始點(diǎn)僅作用于所在復(fù)制子。在復(fù)制子。 注：注：在每個細(xì)胞周期中，每個復(fù)制子發(fā)生一次在每個細(xì)胞周期中，每個復(fù)制子發(fā)生

5、一次復(fù)制，且只發(fā)生一次。復(fù)制，且只發(fā)生一次。第5頁/共71頁質(zhì)粒一般質(zhì)粒一般是一個自主環(huán)狀的是一個自主環(huán)狀的DNADNA基因基因組，構(gòu)成一個獨(dú)立復(fù)制子；組，構(gòu)成一個獨(dú)立復(fù)制子；原核生物原核生物基因組中一般只含一個復(fù)制基因組中一般只含一個復(fù)制子，在唯一的起始點(diǎn)啟動就會引起整子，在唯一的起始點(diǎn)啟動就會引起整個基因組復(fù)制；個基因組復(fù)制；真核生物真核生物基因組含多個復(fù)制子（一般基因組含多個復(fù)制子（一般40-100kb/40-100kb/個）。個）。 2.2 不同生物復(fù)制子的數(shù)目第6頁/共71頁2.3 復(fù)制眼概念 復(fù)制眼：在一個長的未復(fù)制區(qū)域內(nèi)DNA已經(jīng)復(fù)制的區(qū)域第7頁/共71頁Replication

6、eye第8頁/共71頁復(fù)制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復(fù)制能進(jìn)行的部位。2.4 復(fù)制叉的概念及其移動方向的確定第9頁/共71頁復(fù)制叉移動方向的確定放射性自顯影法：放射性自顯影法：對于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，對于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標(biāo)兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標(biāo)記復(fù)制的移動。如果一個脈沖比記復(fù)制的移動。如果一個脈沖比另一個脈沖強(qiáng)，我們可以用相對另一個脈沖強(qiáng)，我們可以用相對的標(biāo)記強(qiáng)度來區(qū)分，這些可用放的標(biāo)記強(qiáng)度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。射自顯影觀察。單向復(fù)制：單向復(fù)制：在復(fù)制眼的一端，一在復(fù)制眼的一端，一種類型的標(biāo)記后緊跟著另一種標(biāo)種類型的標(biāo)記后緊跟著另一種

7、標(biāo)記；記；雙向復(fù)制：雙向復(fù)制：在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)生在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)生一種（對稱的）模式。在真核生一種（對稱的）模式。在真核生物中普遍存在。物中普遍存在。第10頁/共71頁2.5 2.5 復(fù)制的模式復(fù)制的模式-起點(diǎn)、方向和速度起點(diǎn)、方向和速度單起點(diǎn)、單方向多起點(diǎn)、單方向單起點(diǎn)、雙方向多起點(diǎn)、雙方向第11頁/共71頁3 DNA復(fù)制的幾種形式3.1 線性DNA雙鏈的復(fù)制3.2 環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制 第12頁/共71頁3.1 線性DNA雙鏈的復(fù)制線性DNA復(fù)制的具體表現(xiàn)線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的提出線性DNA復(fù)制時(shí)末端問題的解決方案第13頁/共71頁線性DNA復(fù)制的具體表現(xiàn)第14頁/共71頁 線性DNA

8、復(fù)制時(shí)末端問題的提出 所有已知的核酸聚合酶，無論是所有已知的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從聚合聚合酶都只從5端向端向3端移動，端移動，新鏈的合成方新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是向與聚合酶移動方向一致，即只能是5 3； 而對于而對于DNA的合成必需一段的合成必需一段引物引物的存在，體內(nèi)的存在，體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始引物起始DNA合成，起始后它必須合成，起始后它必須切除，切除后，切除，切除后，5端如何起始呢？端如何起始呢？ 這就提出了這就提出了線性線性DNA末端復(fù)制末端復(fù)制的問題。的問題。第15頁/共71頁第16頁/共

9、71頁復(fù)制能在新合成鏈的3端結(jié)束，它如何在5端啟動呢？第17頁/共71頁 線性線性DNADNA復(fù)制時(shí)末端問題的解決方案復(fù)制時(shí)末端問題的解決方案(1(1）通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如如噬噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復(fù)制子）；菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復(fù)制子）；(2(2）某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與幾種線性病毒核酸具有與55端堿基共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中端堿基共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )DNA )。(3(3）DNADNA可形成特殊的結(jié)構(gòu)，

10、如在末端形成發(fā)夾。可形成特殊的結(jié)構(gòu)，如在末端形成發(fā)夾。使分使分子沒有游離末端。草履蟲（子沒有游離末端。草履蟲（ParameciumParamecium）的線性線粒體的線性線粒體DNADNA的復(fù)的復(fù)制中就形成了一種交聯(lián)；制中就形成了一種交聯(lián)；(4(4）末端是可變的，而不是精確確定的。末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，體可能采用這種方式，在這種情況下，DNADNA末端的短重復(fù)序列末端的短重復(fù)序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復(fù)制）；的拷貝數(shù)改變（如端粒的復(fù)制）；第18頁/共71頁（1）通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子第19頁/共71頁The ro

11、lling circle replicates DNAPhage 第20頁/共71頁A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy. 第21頁/共71頁第22頁/共71頁Adenovirus terminal protein binds to the 5 end of DNA and provides a C-OH end to prime synthesis of a new DNA strand.（2） 某種蛋白質(zhì)介入而在真正的末端啟動復(fù)制第23頁/共71頁A

12、denovirus DNA replication is initiated separately at the two ends of the molecule and proceeds by strand displacement. 第24頁/共71頁A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand. The G-tail is generated by a limited degradation of the

13、C-A-rich strand.（4） 末端長度可變第25頁/共71頁A loop forms at the end of chromosomal DNA.第26頁/共71頁The 3 single-stranded end of the telomere (TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop. 第27頁/共71頁Watching flash第28頁/共71頁3. 2 環(huán)狀DNA的復(fù)制-復(fù)制滾環(huán)復(fù)制D-環(huán)復(fù)制第29頁/共71頁復(fù)制 replication by -structure

14、第30頁/共71頁滾環(huán)復(fù)制replication by rolling cycles structure X174X174噬菌體由一個單鏈環(huán)狀噬菌體由一個單鏈環(huán)狀DNADNA組成，這條鏈稱為正（組成，這條鏈稱為正（+ +）鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)）鏈；合成的互補(bǔ)鏈稱為負(fù)（一）鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。（一）鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。第31頁/共71頁The A protein is cis-acting第32頁/共71頁環(huán)復(fù)制Replication by displacement loop structure第33頁/共71頁D-環(huán)復(fù)制（Replication by disp

15、lacement loop structure)第34頁/共71頁4 DNA聚合酶4.1 大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能4.2 真核生物DNA聚合酶的種類及其功能4.3 DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)第35頁/共71頁4.1 大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能SOS 修復(fù)第36頁/共71頁大腸桿菌DNA聚合酶 I、II、 III 的性質(zhì)比較第37頁/共71頁（1）DNA聚合酶聚合酶 I 103 kDa的單鏈多肽，可以被蛋白酶切成兩段，C端的2/3包括聚合酶活性位點(diǎn)；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10個堿基）。（2） 利用DNA聚合酶 I 進(jìn)行缺口平移法制備探針的基本原理聚

16、合酶聚合酶 I 與缺口平移法制備探針與缺口平移法制備探針第38頁/共71頁Nick translation replaces part of a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material. DNase 第39頁/共71頁4.2 真核生物DNA聚合酶的種類及其功能第40頁/共71頁第41頁/共71頁真核生物由不同DNA聚合酶分別負(fù)責(zé)起始和延伸三種細(xì)胞核DNA復(fù)制酶具有不同的功能: DNA polymerase 起始新鏈合成DNA polymerase 延伸先導(dǎo)鏈DNA polymerase 可能與后隨鏈合成

17、有關(guān)，也可能具有其他功能 第42頁/共71頁4.3 DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)許多DNA聚合酶有一個由三個結(jié)構(gòu)域組成的大裂隙，類似于手形。第43頁/共71頁The common organization of DNA polymerases has a palm that contains the catalytic site, fingers that position the template, a thumb that binds DNA and is important in processivity, an exonuclease domain with its own activ

18、e site, and an N-terminal domain.第44頁/共71頁5 原核生物原核生物DNADNA復(fù)制的基本過程復(fù)制的基本過程5.1 DNA復(fù)制的起始5.2 DNA合成鏈的延伸5.3 DNA復(fù)制的終止第45頁/共71頁單鏈DNA的產(chǎn)生3-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生復(fù)制復(fù)合體的形成 5.1 DNA復(fù)制的起始第46頁/共71頁單鏈DNA的產(chǎn)生解旋酶(helicase): 使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；第47頁/共71頁拓?fù)洚悩?gòu)酶 （DNA Topisomerase ） 拓?fù)洚悩?gòu)酶的種類分為拓?fù)洚悩?gòu)酶的種類分為型和型和型。型。 原核拓?fù)錁?gòu)酶原核拓?fù)錁?gòu)酶： MW

19、=100kD，單肽鏈，含，單肽鏈，含34個個Zn。 作用是暫時(shí)切斷一條作用是暫時(shí)切斷一條DNA鏈，形成酶鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再松弛，然后再將切斷的單鏈將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。第48頁/共71頁第49頁/共71頁拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。存在于各種生物中。 使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負(fù)超螺旋，每使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負(fù)超螺旋，每次改變兩個連接數(shù)。次改變兩個連接數(shù)。第50頁/共71頁Replication machineryreplicati

20、onPositive supercoilBreak DNATopoisomerase IIpass DNA through the breaknegative supercoil第51頁/共71頁單鏈結(jié)合蛋白（single-strand binding protein):單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)X174 噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復(fù)制起始點(diǎn)，噬菌體A蛋白使病毒（+）鏈產(chǎn)生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。SSB包繞單鏈形成穩(wěn)定的單鏈形式。Three proteins unwind X174 DNA第52頁/共71頁引發(fā)末端的產(chǎn)生第53頁/共

21、71頁多種方法可以產(chǎn)生3-OH末端1)1)3)3)2)2)第54頁/共71頁第55頁/共71頁5.2 DNA合成鏈的延伸半保留復(fù)制合成兩條新的DNA鏈DNA的合成是半不連續(xù)的連接酶將岡崎片段連接在一起前導(dǎo)鏈和后隨鏈的協(xié)調(diào)合成 DNA復(fù)制忠實(shí)性的控制 第56頁/共71頁(1) 半保留復(fù)制的概念 DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在別作為模板，在DNA聚合酶的聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的組成新的DNA分子。這樣新形分子。這樣新形成的兩個成的兩個DNA分子與親代分子與親代DNA分子

22、的堿基順序完全一樣。由分子的堿基順序完全一樣。由于子代于子代DNA分子中一條鏈來自分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制 (semiconsertive replication)。第57頁/共71頁(2)半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)證據(jù)（Meselson-Stahl) 19581958年年Meselson Meselson & stahl& stahl用同位素用同位素（1515N N）示蹤標(biāo)記示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技加密度梯度離心技術(shù)術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn), ,該實(shí)驗(yàn)跟該實(shí)驗(yàn)跟蹤了生長了三代的蹤了生長了三代的大腸桿菌，大腸

23、桿菌，證明了證明了DNADNA是采取半保留是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制。15N15N-14N14N15N-14N15N-14N第58頁/共71頁的合成是半不連續(xù)的（semidiscontinuous replication) DNA 復(fù)制在合成先導(dǎo)鏈（leading strand) 時(shí)是連續(xù)的；而在合成后隨鏈(lagging strand)時(shí)是先形成小片段（ Okazaki fragment ），隨后再將它們連接而成大片段。因后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的而先導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，所以我們稱之為半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication)。第59頁/共71頁兩條新鏈

24、具有不同的特征The two new DNA strands have different featuresOkazaki fragment第60頁/共71頁連接酶（Ligase)將Okazaki fragment連接在一起第61頁/共71頁前導(dǎo)鏈(Leading strand)和后隨鏈(lagging strand)的協(xié)調(diào)合成第62頁/共71頁聚合酶控制復(fù)制的忠實(shí)性第63頁/共71頁DNA聚合酶造成的復(fù)制錯誤可分為兩類：聚合酶造成的復(fù)制錯誤可分為兩類：移碼（移碼（frameshift): 指一個核苷酸的插入或缺失。指一個核苷酸的插入或缺失。替換（替換（substitution): 指摻入錯誤核苷酸（不正確配對）指摻入錯誤核苷酸（不正確配對）Note: DNA聚合酶通常具有聚合酶通常具有3-5核酸外切酶活性，可以切除錯配堿基；通過校正機(jī)制，復(fù)制核酸外切酶活性，可以切除錯配堿基；通過校正機(jī)制，復(fù)制忠實(shí)性還可提高忠實(shí)性還可提高100倍。倍。(10-310-8-10-10)第64頁/共71頁 細(xì)菌的DNA聚合酶仔細(xì)檢查延長鏈末端的堿基對，如果是錯誤的會予以切除。DNA polymerases have exonuclease activity第65頁/共71頁 修復(fù)會把