高效液相色譜儀操作步驟

1、高效液相色譜儀操作步驟1. 過濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。2. 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3. 打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。4. 進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊 manual ,進(jìn)入手動(dòng)菜單。5. 有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge ,再點(diǎn)擊start,沖洗時(shí)速度不要超過10ml/min 。6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點(diǎn)擊injure，選

2、用合適的流速，點(diǎn)擊on,走基線，觀察基線的情況。7. 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊 file，選取select users and methods ,可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同 的樣品而不同。8. 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun ,可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。

3、全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線， 洗掉剩余物。9. 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。10. 登記。問:用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決？答:關(guān)于漂移問題：1 .溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2. 流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3. 柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡關(guān)于快速變化問題1 .流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2. 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3. 流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合二、 問：液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙

4、峰的原因是什么？</B>答:1 .篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2. 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子三、 問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法</B>答:1 .樣品量不足，解決辦法為增加樣品量2. 樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子3. 樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測(cè)器4. 檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5. 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)6. 檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7. 檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣。8. 記錄儀測(cè)壓范圍

5、不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9. 流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。10 .檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。四、問：做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ </B> 答：原因可能有：1 .泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；2. 比例閥失效，更換比例閥即可；3. 泵密封墊損壞，更換密封墊即可；4. 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；5. 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；6. 梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。五、問：我購買的 HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過高，請(qǐng)問為什么？</B>答：柱壓

6、過高是 HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱 子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1 .拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2. 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下 降，再檢查；3. 將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用 10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4. 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一

7、個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。Agilent1100液相基本操作步驟（一）、開機(jī)：1、打開計(jì)算機(jī)，進(jìn)入 Windows NT （或 Windows 2000）畫面，并運(yùn)行Bootp Server 程序。2 、打開1100 LC各模塊電源。3 、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動(dòng)與1100LC通訊，進(jìn)入的工作站畫面如下所示。4、從 “View”菜單中選擇 “Method and Runcontrol ”畫面，單擊” View” 菜單中的 “Show Top Toolbar

8、”，“Show status toolbar , “Systemdiagram , ” Sampling diagram ,使其命令前有“V 標(biāo)志，來調(diào)用所需的界 面。5、把流動(dòng)相放入溶劑瓶中。6、打開Purge閥。7、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊 Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入泵編輯 畫面。8 、設(shè) Flow: 5ml/min，單擊 OK9、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊 Pumpcontrol選項(xiàng)，選中On, 單擊OK則系統(tǒng)開始Purge,直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止 ，切 換通道繼續(xù)Purge,直到所有要用通道無氣泡為止。10、單擊Pumpffl標(biāo)，出現(xiàn)

9、參數(shù)設(shè)定菜單，單擊PumpControl選項(xiàng)，選中Off, 單擊Ok關(guān)泵，關(guān)閉Purge valve 。11、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊 Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入Pump 編輯畫面，設(shè) Flow: 1.0ml/min。12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo)，如圖所示（以二元泵為例），輸入溶劑的實(shí)際體 積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊 Ok。（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯：1、開始編輯完整方法： 從“Method”菜單中選擇“ Edit entire method ” 項(xiàng)，如上圖所示選中除“Data analysis”外的三項(xiàng)，單擊Ok,進(jìn)入下一畫面。2 、方法信息：在“Method Com

10、ments中加入方法的信息（如：方法的用途等）。單擊Ok進(jìn)入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定：(以二元泵為例) 在“Flow”處輸入流量，如1ml/min，在“Solvent B ”處輸入 70.0,(A=100-B), 也可 Insert 一行” Timetable ” ,編輯梯度。在 “ Pressure Limits Max ”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。 單擊Ok進(jìn)入下一畫面。4、白動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定：選擇合適的進(jìn)樣方式，如圖所示，進(jìn)樣體積1.0ul ,洗瓶位谿為6號(hào)?！癝tandard Injection -只能輸入進(jìn)樣體 積，此方式無洗針功能?！?Injection with Nee

11、dle Wash' - 可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位谿，此方式針從樣品瓶抽完樣品后， 會(huì)在洗瓶中洗針?！?Use injectorprogram” -可以點(diǎn)擊Edit鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定： 在” Temperature ”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度，并選中它，點(diǎn)擊” more>>'鍵，如圖所示，選中” Same as left -使柱溫箱的溫度左右一 致。 點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫面。6、VW瞼測(cè)器參數(shù)設(shè)定： 在” Wavelength ”下方的空白處輸入所需的檢測(cè)波長，如254nm,在” Peak width (Response tim

12、e) ”下方點(diǎn)擊下拉式三角框，選擇合適的響應(yīng)時(shí) 間,如>0.1min (2s) 。 在 Timetable 中可以 “ Insert ” 一行，輸入隨時(shí)間切換的波長，如1min ，波長=300nm點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫面。7、DAD僉測(cè)器參數(shù)設(shè)定： 檢測(cè)波長：254nm,BW=30nm, 參比波長=350nm,BW=100nm; 檢測(cè)波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW 一股選擇最大吸收值一半處的整個(gè)寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無吸收或低吸 收區(qū)域。參比帶寬BW至少要與樣品信號(hào)的帶寬相等，許多情況下用100nm作 為缺省值。Peak width (Response tim

13、e ):其值盡可能接近要測(cè)的窄峰峰寬。 Slit 狹縫窄，光譜分辨率高；寬時(shí)，噪音低。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步 長，范圍，閾值。選中所用的燈。 點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫面。8、RID檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定： 色譜條件：進(jìn)樣體積:20ul 。光學(xué)單元溫度：Off 。極性：正。峰寬(響應(yīng)時(shí)間):4s 。 如圖所示："Optical Unit Temperature -若環(huán)境溫度控制在土 2C，設(shè)定為Off,若環(huán)境溫度不穩(wěn)定，則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度，以防樣品在池中沉淀?！?Peak width” -大多數(shù)分析設(shè)為4S,只有在高速分析下設(shè) 為更短。"Automatic recy

14、cling after analysis ” -在不進(jìn)行分析時(shí)可以讓 流動(dòng)相循環(huán)，節(jié)省流動(dòng)相，檢測(cè)器連續(xù)運(yùn)行，可隨時(shí)投入使用。 * 點(diǎn)擊RID圖標(biāo)，選擇 RID Control : Heater設(shè)為On,若要循環(huán) 流動(dòng)相，必須將“ Recycling Valve ”設(shè)為ON手動(dòng)purge參比池，將其設(shè)為 On,并輸入Purge時(shí)間。9、FLD檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定：色譜條件： 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1：10。 進(jìn)樣體積：5ul o 柱溫箱：30 C。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=1Q 響應(yīng)時(shí)間=4s. 停止時(shí)間： 出峰完畢。 Excitation A：

15、激發(fā)波長：200-700nm,步長為 1nm,或 Zero Order 。Emission :發(fā)射波長:280-900nm, 步長為 1nm,或 Zero Order。 PMT大多數(shù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭，則減少PMT值。 “Peak width:大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s,只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Multi Ex :多波長及光譜（激發(fā)）。 Multi Em :多波長及光譜（發(fā)射）。 同時(shí)可以輸入范圍Range步長step、采集光譜。10、在“ Run time checklist ”中選中 “ Data acquisition ” ,單擊Ok11、單擊 “Method”

16、 菜單，選中 “ Save method as”，輸入一方法名，如“test ”，單擊。虻12、從菜單“View” 中選中” Online signal ，選中 Windows1,然后單擊Change鈕,將所要繪圖的信號(hào)移到右邊的框中，點(diǎn)擊 Ok.（如同時(shí)檢測(cè)二個(gè)信號(hào)，則重復(fù)12,選中Windows 2）。13、從 “Run control ”菜單中選擇 “ Sample info ” 選項(xiàng)，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“ Data file”中選擇“ Manual”或“Prefix ”。區(qū)別：Manual-每次做樣之前必須給出新名字，否則儀器會(huì)將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。Prefix 在Prefi

17、x 框中輸入前綴，在Counter框中輸入計(jì)數(shù)器的起始位，儀器會(huì)白動(dòng)命名，如vwd0001,vwd0002,。14、從 Instrument 菜單選擇 System on。15、 等儀器Ready,基線平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Runmethod”， 進(jìn)樣。(DAD, VW匝譜圖如下所示：)(三) 、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、從“View”菜單中，單擊" Data analysis ”進(jìn)入數(shù)據(jù)分 析畫面。2、從“File ”菜單選擇“ Load signal ”，選中您的數(shù)據(jù)文 件名，如下圖所示。單擊O43、做譜圖優(yōu)化，從“Graphics ”菜單中選擇“Signal option

18、s ” 選項(xiàng)，。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時(shí)間， 單擊ok,或選擇” Use Ranges”調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到 圖的比例合適為止。4、積分：(1) 、從"Integration ”中選擇 “Auto integrate ”，如積分結(jié)果不理想，再從菜單中選擇 Integration Events”選項(xiàng)，選擇合適的 Slope sensitivity ,Peak width , Area reject , Height reject 。(2) 、從"Integration ”菜單中選擇Integrate ”選項(xiàng)，則數(shù)據(jù)被積分。(3) 、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。(4) 、單擊左邊 W 圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。5、打印報(bào)告：(1)、從“Report ”菜單中選擇“ Specify report ”選項(xiàng)，進(jìn)入如上畫面。、單擊&quo