慢性粒細胞白血病細胞eIF4EmRNA表達及影響因素

1、慢性粒細胞白血病細胞eIF4E mRNA表達及影響因素 作者：黃蓮芬 羅紅偉 肖青 彭輝 馮文莉 【摘要】 目的： 初步探索真核細胞翻譯起始因子4E(eIF4E)在慢性粒細胞白血病（CML）不同病程，包括慢性期（CP）、加速期(AP)、急變期(BC)、急變治療后(BCR)骨髓細胞中mRNA表達及其在K562細胞中的表達影響因素. 方法： RTPCR檢測25例骨髓樣本CML急變期（CMLBC）10例，慢性期(CMLCP)8例，加速期（CMLAP）1例，急變期治療后（CMLBCR）3例，貧血對照3例eIF4E mRNA表達，及其中9例CML eIF4E和RNA結合蛋白K（hnRNP K）mRNA表

2、達，并分析兩種基因表達相關性. 用酪氨酸激酶抑制劑STI571處理K562細胞，并用hnRNP K 短發(fā)夾RNA(shRNA)逆轉錄病毒載體感染K562細胞，經(jīng)G418穩(wěn)定篩選，分別檢測eIF4E mRNA表達變化. 結果： 與貧血對照組相比，CMLBC和CMLBCR eIF4E mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而與CMLCP無統(tǒng)計學意義，hnRNP K與eIF4E mRNA表達呈線性相關（r=0.79, P<0.01）.STI571能輕微下調(diào) K562細胞eIF4E mRNA表達.hnRNP K干擾組hnRNP K和eIF4E mRNA表達比空載對照

3、組分別下降55.22，55.27%. 結論： CML急變期eIF4E mRNA表達顯著增高，BCR/ABL融合蛋白可能參與調(diào)節(jié)eIF4E mRNA表達但效應有限，hnRNP K分子在eIF4E mRNA表達調(diào)控中可能發(fā)揮一定作用. 1 / 19【關鍵詞】 白血病，髓樣，慢性；真核細胞起始因子4E；STI571；核糖核蛋白K，核不均一 0引言 慢性粒細胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia，CML）是源于造血干細胞異常的惡性克隆性增殖性疾病，具有特征性的ph染色體和bcr/abl融合基因，所編碼的BCR/ABL融合蛋白具有異常的酪氨酸激酶活性，是CML發(fā)生和發(fā)展的主要

4、因素，在CML從慢性期(CMLCP)向急變期(CMLBC)轉化過程中起關鍵作用，然而急變的具體機制仍不清楚.研究報道，真核細胞翻譯起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)在很多的人類腫瘤中過表達，可促進腫瘤增殖1，抑制凋亡2，阻滯分化1,3-4.研究5發(fā)現(xiàn)，mRNA帽結合復合物（eIF4F）是CML急變時一個重要治療靶標，而eIF4E是該復合物重要的組成部分.已知RNA結合蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)在CML急變細胞中高表達6，而hnRNP K

5、蛋白在Hela細胞中通過轉錄水平升高eIF4E表達而誘導惡性表型發(fā)生7.我們選擇eIF4E為切入點，采用RTPCR技術在CML細胞中檢測eIF4E mRNA表達，并進一步探討其與BCR/ABL融合蛋白及其下游分子hnRNP K之間的關系，旨在為CML急變提供新的分子治療靶點. 1材料和方法 1.1材料采集2006/2007年間重慶醫(yī)科大學附屬第一、二醫(yī)院血液科診斷為CML的患者骨髓標本22例，其中,CMLCP 8例，加速期(CMLAP)1例， CMLBC 10例，急變治療后有所緩解(CMLBCR)3例，以及貧血對照骨髓3例.MMLV逆轉錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶Ecor，Hind，DNA Mark

6、er等（TaKaRa公司）；質粒抽提試劑盒（Qiagen公司）；TransfastTM轉染試劑（Promega公司）；G418（Invitrogen公司）；酪氨酸激酶抑制劑STI571獲贈于諾華制藥公司.DH5菌株和K562細胞株和PT67細胞由本室儲存.pSUPER retro hnRNP K shRNA(含有5tggtgaatttggtaaacgc3)和pSUPER retro neo+gfp逆轉錄病毒載體獲贈于Danilo Perrotti教授6.根據(jù)人eIF4E mRNA序列(NM_001968)以及hnRNP K mRNA序列（NM_002140，NM_031262，NM_03126

7、3），利用Primer Premier 5.0軟件自行設計PCR引物，由上海生物工程技術有限公司合成.eIF4E引物,P1：5ACGGAATCTAATCAGGAGGT3，P2：5TTCCCACATAGGCTCAATAC3，產(chǎn)物長度：246 bp.hnRNP K引物，P1：5CCCGATAGGGTTGTAGAGTG3，P2：5ATTGCAGAG TCCCAAGTTTC3，產(chǎn)物長度：452 bp.actin引物，P1：5GTGGACATCCGCAAAGAC3，P2：5AAAGG GTGTAACGCAACTAA3，產(chǎn)物長度：302 bp. 1.2方法 1.2.1骨髓單個核細胞的分離及總RNA提取取抗

8、凝骨髓2 mL，加入等量的Hanks液稀釋，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離單個核細胞并根據(jù)Trizol法提取總RNA步驟，提取骨髓總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，并計算其含量. 1.2.2RTPCR檢測CML和貧血對照骨髓eIF4E，hnRNP K mRNA表達每20 L逆轉錄反應體系用總RNA 1 g，按MMLV逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA，cDNA產(chǎn)物于-20保存. PCR擴增采用20 L體系，內(nèi)含cDNA 2 L， 10 mol/L引物0.5 L，10×PCR緩沖液2 L，25 mmol/L MgCl2 1.6 L， 2.5 mol/L dNTP 2 L

9、，Taq酶0.5 U. actin基因擴增條件：94 預變性3 min，再94 20 s，56 40 s，72 20 s 28個循環(huán)，72 延伸10 min，eIF4E基因擴增條件：94 預變性5 min，再94 20 s，60 40 s，72 20 s 5個循環(huán)后，再94 20 s，56 40 s，72 20 s 25個循環(huán)，72延伸10 min，hnRNP K基因擴增條件：94預變性5 min，再94 20 s，56 40 s，72 20 s 29個循環(huán)后，72 延伸10 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相，在BioRad凝膠成像儀上觀察分析，以目的基因/act

10、in的比值R代表目的基因相對表達豐度. 1.2.3RTPCR檢測STI571對K562細胞eIF4E mRNA表達的影響常規(guī)培養(yǎng)K562細胞，新鮮換液后將K562細胞按1×106個/孔加到6孔板中，共6孔，第1孔不加任何物質，第2孔加入DMSO溶劑作為溶劑空白對照，第3，4，5，6孔加入DMSO融解的STI571使其終濃度分別為0.5，1.0，2.5，5.0 mol/L，處理24 h后收集6孔處理組細胞，Trizol法裂解提取總RNA，逆轉錄成cDNA后，PCR擴增eIF4E和actin基因反應條件和分析同上，計算與實驗平行的未處理對照組（a）, DMSO試劑空白對照組和各濃度STI

11、571處理組eIF4E基因/actin基因條帶灰度值比值，記為R. 1.2.4RTPCR檢測hnRNP K shRNA對 K562細胞eIF4E和hnRNP K mRNA表達的影響將pSUPER retro hnRNP K shRNA逆轉錄病毒載體和空載pSUPER retro neo+gfp分別轉化至DH5感受態(tài)細菌，增菌提取質粒后經(jīng)Ecor和Hind酶切和測序鑒定，克隆質粒序列正確. 用TransfastTM脂質體將質粒轉染PT67包裝細胞，轉染后G418篩選約2 wk，挑取綠色熒光克隆擴大培養(yǎng)，建立逆轉錄病毒穩(wěn)定包裝細胞株，收集hnRNP K shRNA和空載對照逆轉錄病毒上清用于感染K

12、562細胞，經(jīng)用G418篩選，獲得穩(wěn)定表達hnRNP K shRNA以及空載對照組K562細胞.Trizol法提取各處理組總RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增eIF4E，actin和hnRNP K基因反應條件和分析同上，計算各處理組目的基因/actin基因條帶灰度值比值R.由于eIF4E基因與細胞分化有關，而K562細胞隨著培養(yǎng)時間的延長極易發(fā)生自分化，故設立與實驗平行的未處理對照組（a）,以及該組細胞繼續(xù)培養(yǎng)3 wk的另一未處理對照組（b）. 統(tǒng)計學處理： 用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行多個樣本均數(shù)與貧血對照組均數(shù)比較的Dunnettt檢驗，以及相關和回歸分析，以P<0.0

13、5為差異有統(tǒng)計學意義. 2結果 2.1CML和正常骨髓細胞中eIF4E 和hnRNP K mRNA的表達RTPCR檢測22例中的10例CML和3例貧血對照骨髓actin和eIF4E基因，以及其中9例CML hnRNP K mRNA表達（圖1）.CMLCP，CMLBC，CMLBCR組CML骨髓eIF4E基因R值分別為0.47±0.13,1.04±0.13,0.67±0.04，對照組骨髓eIF4E基因R值為0.32±0.12.CMLBC，CMLBCR組eIF4E mRNA的表達與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而CMLCP組與對照

14、組相比，差異無統(tǒng)計學意義.以反映K562細胞和9例CML骨髓細胞hnRNP K和eIF4E mRNA表達的R值分別作為自變量X和應變量Y繪制成散點圖（圖2），發(fā)現(xiàn)X與Y有伴隨線性趨勢，相關分析得到兩者相關系數(shù)r=0.79，P<0.01，線性回歸得Y=0.15+0.56X. A：CML骨髓eIF4E mRNA表達；110：10例CML骨髓樣本；M：DL2000 marker. B：CML骨髓actin mRNA表達；110：10例CML骨髓樣本；M：DL2000 marker. C：CML骨髓hnRNP K mRNA表達；19: 9例CML骨髓樣本；M：DL2000 marker.

15、 D：貧血對照骨髓eIF4E和actin mRNA；13：3例貧血對照骨髓；K：K562細胞；M：DL2000 marker. 圖1CML和貧血對照骨髓細胞eIF4E和hnRNP K基因RTPCR電泳 2.2STI571對K562細胞eIF4E mRNA表達的影響未處理對照組、DMSO試劑空白對照組及0.5，1.0，2.5，5.0 mol/L 4種STI571濃度處理組K562細胞eIF4E mRNA RTPCR電泳結果見圖3. STI571在一定程度上能夠使K562細胞中eIF4E mRNA表達降低. 圖29例CML和K562細胞eIF4E和hnRNP K基因R值散點圖 A：各濃度STI57

16、1處理組K562細胞eIF4E mRNA表達；14：5.0, 2.5, 1.0, 0.5 mol/L STI571濃度處理組；5：DMSO試劑空白對照組；6：未處理對照組（a）；M：DL2000 marker. B：各濃度STI571處理組K562細胞actin mRNA表達；14：5.0, 2.5, 1.0, 0.5 mol/L STI571濃度處理組；5：DMSO試劑空白對照組；6：未處理對照組（a）；M：DL2000 marker. 圖3各濃度STI571處理組K562細胞eIF4E和actin mRNA表達RTPCR電泳 2.3hnRNP K shRNA對K562細胞eIF4E和 hn

17、RNP K mRNA表達的影響hnRNP K干擾組和空載對照組K562細胞eIF4E和hnRNP K RTPCR電泳結果分別見圖4，5.各組K562細胞hnRNP K基因計算所得R值分別為：干擾組0.79，空載對照組1.77，未處理對照組1.32，eIF4E基因各處理組所得R值分別為：干擾組D 0.24，空載對照組C 0.54，未處理對照組(a)為0.51，未處理對照組(b)為0.69.干擾組hnRNP K mRNA表達較空載對照組降低了55.22，而eIF4E mRNA表達較空載對照組降低55.27. 1：未處理對照組(a)；2：空載對照組；3：干擾組；M：DL2000marker. 圖4各

18、處理組K562細胞hnRNP K基因RTPCR電泳 1: 未處理對照組(b)；2：未處理對照組(a)；3：空載對照組；4：干擾組；M：DL2000marker. 圖5各處理組K562細胞eIF4E基因RTPCR電泳 3討論 新近發(fā)現(xiàn)的原癌基因eIF4E在調(diào)節(jié)細胞蛋白質合成和帽依賴翻譯中起重要作用，過表達eIF4E蛋白可加強蛋白質合成速度，加速mRNA由細胞核向細胞質轉移，選擇性加強原癌基因等弱“RNA”的翻譯8，亦參與控制細胞周期進展和細胞增殖9.在CML慢性期晚期，eIF4E蛋白表達水平和磷酸化以BCR/ABL依賴方式升高10，Topisirovic3等報道CML急變期eIF4E表達水平升高

19、，提示eIF4E可能與CML病程進展有關.CML細胞中hnRNP K蛋白表達水平呈BCR/ABL依賴方式升高6，而hnRNP K蛋白在Hela細胞中通過轉錄水平升高eIF4E表達而誘導細胞惡性表型發(fā)生7.我們的預實驗顯示，CML急性紅系變K562細胞株中eIF4E mRNA高表達，CML急變期細胞高表達hnRNP K蛋白，提示CML急變期細胞中hnRNP K蛋白可能與eIF4E基因表達有關. 我們的實驗結果表明，CMLBC而非慢性期eIF4E基因mRNA表達較貧血對照顯著升高，說明eIF4E mRNA表達與CML病程有關，而eIF4E和hnRNP K mRNA表達水平呈線性正相關，提示CMLB

20、C eIF4E mRNA表達顯著升高可能與hnRNP K高表達有關. K562細胞中，STI571可以在一定程度下調(diào)eIF4E mRNA水平，但是eIF4E mRNA表達仍然很高，說明BCR/ABL融合蛋白可能參與促進eIF4E表達，但是很可能還有其它因素在調(diào)控eIF4E表達中發(fā)揮重要作用. 另外，hnRNP K基因沉默能顯著降低hnRNP K和eIF4E mRNA水平，提示hnRNP K很可能在eIF4E mRNA表達調(diào)控中發(fā)揮一定作用. 研究11表明，cmyc蛋白促進elF4E基因轉錄，K562細胞中p53蛋白通過結合cmyc蛋白而抑制elF4E基因轉錄，而CML急變時常常伴隨p53基因突

21、變或缺失，同時，在CML急變細胞中HnRNP K蛋白高表達，它從翻譯水平促進cmyc蛋白表達6，這些可能都是eIF4E表達過高的原因. 以上分析表明，eIF4E可能是CML急變一個重要的癌基因，而通過靶向抑制eIF4E來治療腫瘤的臨床實驗也正在進行中12，我們的結果提示，eIF4E有可能成為CML急變期一新的潛在治療靶點，為我們進一步的深入研究奠定了一定的基礎. 致謝衷心感謝重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液骨髓室潘健老師和本課題組全體成員，臨床檢驗診斷學省部共建教育部重點實驗室全體老師! 【參考文獻】 1 Provenzani A, Fronza R, Loreni F, et al.Global

22、 alterations in mRNA polysomal recruitment in a cell model of colorectal cancer progression to metastasisJ. Carcinogenesis, 2006, 27(7): 1323-1333. 2 Larsson O, David MP, Fan DH, et al.Apoptosis resistance downstream of eIF4E: posttranscriptional activation of an antiapoptotic transcript carrying a

23、consensus hairpin structureJ. Nucleic Acid Res, 2006, 34(16): 4375-4386. 3 Topisirovic I, Guzman ML, McConnell MJ, et al. Aberrant eukaryotic translation initiation factor 4Edependent mRNA transport impedes hematopoietic differentiation and contributes to leukemogenesisJ. Mol Cell Biol, 2003, 23(24)

24、:8992-9002. 4 Montserrat PD, Godfrey G, Lindern M. Translation initiation factor 4E inhibits differentiation of erythroid progenitorsJ. Mol Cell Biol, 2005, 25(19): 8496-8506. 5 Prabhu S, Saadat D, Zhang M. A novel mechanism for BcrAbl action: BcrAblmediated induction of the eIF4F translation initia

25、tion complex and mRNA translationJ. Oncogene, 2007, 26(8):1188-2000. 6 Notari M, Neviani P, Perrotti D, et al. A MAPK/HNRNP K pathway controls BCR/ABL oncogenic potential by regulating MYC mRNA translationJ. Blood, 2006, 107(6):2507-2516. 7 Lynch M, Chen L, Michael J, et al. hnRNP K binds a core polypyrimidine element in the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) promoter, and its regulation of eIF4E contributes to neoplastic transformationJ. Mol Cell Biol， 2005, 25(15): 6436-6453. 8 De BenedettiA, Graff JR. eIF4E expression and i