代謝組學：基于質(zhì)譜的研究方法

1、代謝組學：基于質(zhì)代謝組學：基于質(zhì)譜的研究方法譜的研究方法內(nèi)容提要內(nèi)容提要一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識二、二、 GC-MS GC-MS和和LC-MSLC-MS三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識1 1、什么是代謝組學、什么是代謝組學 代謝組學是通過比較對照組和實驗組的代謝組代謝組學是通過比較對照組和實驗組的代謝組（metabolomesmetabolomes，某一生物的所有代謝物組分），以尋，某一生物的所有代謝物組分），以尋找其它代謝譜差異的研究方法。這些差異可能與臨床找其它代謝譜差異的研究方法。這些差異可能與臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)中研究的某些疾病相關

2、，也可能與藥生物標志物發(fā)現(xiàn)中研究的某些疾病相關，也可能與藥物研發(fā)毒理研究中候選藥物攝入后的代謝改變有關。物研發(fā)毒理研究中候選藥物攝入后的代謝改變有關。一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識2 2、代謝組學的一般流程、代謝組學的一般流程發(fā)現(xiàn)代謝組學發(fā)現(xiàn)代謝組學靶向代謝組學靶向代謝組學代謝組學代謝組學一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識3 3、發(fā)現(xiàn)代謝組學的一般流程、發(fā)現(xiàn)代謝組學的一般流程鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝物的化學結(jié)構(gòu)物的化學結(jié)構(gòu)代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對照樣品中，尋找

3、豐度改變有統(tǒng)計學意義的感興趣代謝物照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計學意義的感興趣代謝物解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識4 4、靶向代謝組學的一般流程、靶向代謝組學的一般流程 靶向代謝組學分析的重點是采用大量天然和生物變異靶向代謝組學分析的重點是采用大量天然和生物變異樣本，驗證預先確認的代謝物。需要用分析標準品進行樣本，驗證預先確認的代謝物。需要用分析標準品進行定量分析。定量分析。一、代謝組學基本知識一、代謝組學基本知識5 5、代謝組學的一般流程

4、、代謝組學的一般流程二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS1 1、質(zhì)譜在代謝組學中的應用、質(zhì)譜在代謝組學中的應用 質(zhì)譜質(zhì)譜(MS)(MS)因具有廣泛的動態(tài)范圍、能進行可重現(xiàn)的定因具有廣泛的動態(tài)范圍、能進行可重現(xiàn)的定量分析，而且能夠分析非常復雜的生理體液，已被用于量分析，而且能夠分析非常復雜的生理體液，已被用于代謝組學的研究中。由于這類樣品的復雜性，為了盡可代謝組學的研究中。由于這類樣品的復雜性，為了盡可能多地檢測代謝物，在質(zhì)譜分析之前常常還要進行分離能多地檢測代謝物，在質(zhì)譜分析之前常常還要進行分離（氣相色譜、液相色譜或毛細管電泳）（氣相色譜、液相色譜或毛細管電泳）2 2、代謝組學

5、中所用的分離技術、代謝組學中所用的分離技術氣相色譜(GC) GC GC 要求揮發(fā)性，要用化學衍生化的樣品要求揮發(fā)性，要用化學衍生化的樣品液相色譜(LC) 不能完全解決代謝組中親水組分的分離問題不能完全解決代謝組中親水組分的分離問題毛細管電泳(CE) 所用的緩沖液卻不能與質(zhì)譜儀的離子源兼容所用的緩沖液卻不能與質(zhì)譜儀的離子源兼容 親水相互作用色譜(HILIC)二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS3 3、代謝組學的挑戰(zhàn)、代謝組學的挑戰(zhàn) 1 1、典型的代謝組學實驗需大量樣品才能得到精確統(tǒng)計的結(jié)果、典型的代謝組學實驗需大量樣品才能得到精確統(tǒng)計的結(jié)果 2 2、代謝組學研究通常需要多種技術；

6、某種類型的樣品往往比其、代謝組學研究通常需要多種技術；某種類型的樣品往往比其他樣品更適合采用某種特定的分析技術他樣品更適合采用某種特定的分析技術 3 3、需要高度靈敏和精確的儀器、需要高度靈敏和精確的儀器 4 4、強大的軟件工具對處理實驗所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)非常重要、強大的軟件工具對處理實驗所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)非常重要 處處理理GC/MS GC/MS 和和LC/MS LC/MS 數(shù)數(shù)據(jù)的色據(jù)的色譜譜解卷解卷積積程序、程序、尋尋找有意找有意義義代代謝謝物的一系列物的一系列統(tǒng)計統(tǒng)計分析工具、分析工具、幫幫助助鑒鑒定代定代謝謝物的代物的代謝謝物物數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)庫庫，以及最以及最終繪終繪制分子制分子間間相互作用相互

7、作用網(wǎng)絡圖網(wǎng)絡圖的生物信息的生物信息學軟學軟件等。件等。二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 氣相色譜和質(zhì)譜氣相色譜和質(zhì)譜(GC/MS)(GC/MS)是分析揮發(fā)性化學物質(zhì)的有效組是分析揮發(fā)性化學物質(zhì)的有效組合。氣相色譜使用運載氣推動分析物通過涂漬的熔融石英毛合。氣相色譜使用運載氣推動分析物通過涂漬的熔融石英毛細管?；诜治鑫镌跉庀嗪兔毠軆?nèi)涂層之間的不同分配實細管?；诜治鑫镌跉庀嗪兔毠軆?nèi)涂層之間的不同分配實現(xiàn)分離。現(xiàn)分離。 二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 電子轟擊電離電子轟

8、擊電離(EI)(EI)是是GC/MS GC/MS 最常用的電離技術，非常耐用最常用的電離技術，非常耐用而且重現(xiàn)性好，而且不會受離子抑制的影響而且重現(xiàn)性好，而且不會受離子抑制的影響 簡單的鑒定方法只需要扣除了背景的簡單的鑒定方法只需要扣除了背景的EI EI 圖譜，和一個通用圖譜，和一個通用EIEI譜庫檢索，如譜庫檢索，如NIST NIST 譜庫。更有效的鑒定方法是采用包含了譜庫。更有效的鑒定方法是采用包含了預期的化合物保留時間和預期的化合物保留時間和EI EI 圖譜的特定應用數(shù)據(jù)庫同時對分圖譜的特定應用數(shù)據(jù)庫同時對分析物的色譜保留時間和質(zhì)譜圖進行檢索析物的色譜保留時間和質(zhì)譜圖進行檢索二、二、GC

9、-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 EI源的缺點 EI EI 電離經(jīng)常會導致分子離子的丟失電離經(jīng)常會導致分子離子的丟失-找不到匹配找不到匹配的的EIEI譜譜-缺少的分子離子的質(zhì)量信息將使可能的化合物的數(shù)缺少的分子離子的質(zhì)量信息將使可能的化合物的數(shù)量變得非常龐大量變得非常龐大 因此，因此，GC/MSGC/MS最適合對已知的或預期的代謝物進行分析最適合對已知的或預期的代謝物進行分析二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS5 5、LC/MS LC/MS 分析分析 液相色譜可以分離無揮發(fā)性和未衍生化的代謝物。因此，液相色譜可以分離無揮發(fā)性和未衍

10、生化的代謝物。因此，LC/MSLC/MS可以分析的化合物種類范圍比可以分析的化合物種類范圍比GC/MS GC/MS 更廣更廣 電噴霧電噴霧(ESI) (ESI) 和大氣壓化學電離和大氣壓化學電離(APCI)(APCI)是是LC/MS LC/MS 最常用的兩最常用的兩種電離技術種電離技術-ESI -ESI 和和APCI APCI 都可能出現(xiàn)離子抑制，因此共洗脫都可能出現(xiàn)離子抑制，因此共洗脫化合物可能被低估甚至檢測不到化合物可能被低估甚至檢測不到 二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS5 5、LC/MS LC/MS 分析分析 目前沒有可用于目前沒有可用于LC/MS LC/MS 鑒定的

11、譜庫。但由于鑒定的譜庫。但由于LC/MS LC/MS 分析中分析中通常都有分子離子，其質(zhì)量可以用代謝物數(shù)據(jù)庫進行檢索，如通常都有分子離子，其質(zhì)量可以用代謝物數(shù)據(jù)庫進行檢索，如METLIN METLIN 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 Q-TOF Q-TOF可以通過分子離子計算出經(jīng)驗式可以通過分子離子計算出經(jīng)驗式 LC/MS LC/MS 最適合作為未知代謝物研究中的探索方法，或者在多最適合作為未知代謝物研究中的探索方法，或者在多種目標代謝物由于揮發(fā)性問題不能用種目標代謝物由于揮發(fā)性問題不能用GC/MS GC/MS 進行分析時采用進行分析時采用二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS6 6、LC/MS

12、LC/MS 、GC/MSGC/MS分析化合物的范圍分析化合物的范圍二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學1 1、發(fā)現(xiàn)代謝組學的概念、發(fā)現(xiàn)代謝組學的概念發(fā)現(xiàn)代謝組學主要是將對照組和實驗組的代謝組（某一生物發(fā)現(xiàn)代謝組學主要是將對照組和實驗組的代謝組（某一生物體的全部代謝物）進行比對，以找出其代謝譜的差異。體的全部代謝物）進行比對，以找出其代謝譜的差異。發(fā)現(xiàn)代謝組學分析一般包括以下幾個步驟：發(fā)現(xiàn)代謝組學分析一般包括以下幾個步驟： 代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對照代謝譜分析（也稱為差異表達分析），在一組實驗和對照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計

13、學意義的感興趣代謝物樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計學意義的感興趣代謝物 鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝物的化學結(jié)構(gòu)鑒定，進行代謝譜分析后，測定這些代謝物的化學結(jié)構(gòu) 解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)過程或生物狀態(tài)之間的關聯(lián)三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學2 2、代謝譜分析，尋找有統(tǒng)計學意義的代謝物、代謝譜分析，尋找有統(tǒng)計學意義的代謝物 分析重現(xiàn)性對表達譜分析至關重要分析重現(xiàn)性對表達譜分析至關重要-分析變異越小，分析變異越小，所需的重復數(shù)就越少所需的重復數(shù)就越少 代謝譜分析是經(jīng)過復雜的特征提取，對已知代謝

14、物進行代謝譜分析是經(jīng)過復雜的特征提取，對已知代謝物進行靶向代謝譜分析，以尋找意外的代謝物靶向代謝譜分析，以尋找意外的代謝物-代謝物以其分子代謝物以其分子特征為標志表示，包括保留時間、質(zhì)量或質(zhì)譜圖及豐度特征為標志表示，包括保留時間、質(zhì)量或質(zhì)譜圖及豐度 在代謝譜分析過程中，并不一定要知道該化合物在代謝譜分析過程中，并不一定要知道該化合物/ / 代謝代謝物是什么。但為了在不同次的樣品分析之間跟蹤這些化合物，物是什么。但為了在不同次的樣品分析之間跟蹤這些化合物，必需要用到其物理性質(zhì)必需要用到其物理性質(zhì)三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學3 3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟 1 1

15、、 分析，包括代謝物的分離和檢測，一般采用分析，包括代謝物的分離和檢測，一般采用GC/MS GC/MS 或或LC/MSLC/MS 2 2、 尋找特征，包括尋找樣品中的所有代謝物。一個代謝尋找特征，包括尋找樣品中的所有代謝物。一個代謝物檢測不到，就意味著喪失了一次機會；因此盡可能多地檢物檢測不到，就意味著喪失了一次機會；因此盡可能多地檢測出樣品中的代謝物至關重要測出樣品中的代謝物至關重要三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學3 3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學 3 3、數(shù)據(jù)標準化，對保留時間和響應的漂移給予必要的校正、數(shù)據(jù)標準化，對保留時間和響

16、應的漂移給予必要的校正 4 4、統(tǒng)計分析，用于發(fā)現(xiàn)樣品組別之間的統(tǒng)計學差異、統(tǒng)計分析，用于發(fā)現(xiàn)樣品組別之間的統(tǒng)計學差異 5 5、鑒定，、鑒定，GC/MS GC/MS 所得的所得的EI EI 圖譜非常適合進行譜庫檢索圖譜非常適合進行譜庫檢索 6 6、解釋，一旦代謝物被鑒定出來，就需要通過解釋實驗結(jié)、解釋，一旦代謝物被鑒定出來，就需要通過解釋實驗結(jié)果，推斷其在代謝的生物通路中的地位果，推斷其在代謝的生物通路中的地位3 3、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟、發(fā)現(xiàn)代謝組學有以下六個步驟三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4 4、安捷倫、安捷倫GC/MS GC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在

17、 分析 方面： 良好的重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正良好的重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正 卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣品卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣品 高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍超過超過6 6 個數(shù)量個數(shù)量三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4 4、安捷倫、安捷倫GC/MS GC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 尋找特征 方面：安捷倫提供自動化質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件安捷倫提供自動化質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件(AMDIS) (AMDIS) 進行解卷進

18、行解卷積，該軟件是積，該軟件是NIST NIST 譜庫檢索軟件包的一部分。譜庫檢索軟件包的一部分。AMDIS AMDIS 軟件軟件包設計用于：包設計用于： 發(fā)現(xiàn)相關的協(xié)變離子，用單組分色譜峰表示發(fā)現(xiàn)相關的協(xié)變離子，用單組分色譜峰表示 從復雜的從復雜的GC/MS GC/MS 數(shù)據(jù)中提取出單純組分質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)中提取出單純組分質(zhì)譜圖 重建用于重建用于EI EI 譜庫檢索的質(zhì)譜圖譜庫檢索的質(zhì)譜圖三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4 4、安捷倫、安捷倫GC/MS GC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 數(shù)據(jù)標準化和統(tǒng)計學分析 方面：統(tǒng)計學分析軟件需要具備以下功能：統(tǒng)計學分析軟件需要具備以

19、下功能： 從大樣本組和復雜的實驗設計中，對數(shù)據(jù)（包括元數(shù)據(jù)）進從大樣本組和復雜的實驗設計中，對數(shù)據(jù)（包括元數(shù)據(jù)）進行輕松輸入、標準化和對比行輕松輸入、標準化和對比 發(fā)現(xiàn)復雜的實驗設計中數(shù)據(jù)間的聯(lián)系發(fā)現(xiàn)復雜的實驗設計中數(shù)據(jù)間的聯(lián)系不局限于兩兩對比不局限于兩兩對比 鑒定后能夠通過通路分析進行生物學解釋鑒定后能夠通過通路分析進行生物學解釋安捷倫的安捷倫的Mass Profiler Mass Profiler 專業(yè)軟件讓您能夠輕松輸入、標準化、專業(yè)軟件讓您能夠輕松輸入、標準化、比較并圖形化顯示大樣本組的比較并圖形化顯示大樣本組的GC/MS GC/MS 和和LC/MS LC/MS 數(shù)據(jù)，從而數(shù)據(jù)，從而快

20、速發(fā)現(xiàn)代謝物標志物，并支持元數(shù)據(jù)分析。我們用的是快速發(fā)現(xiàn)代謝物標志物，并支持元數(shù)據(jù)分析。我們用的是SIMCA-PSIMCA-P三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4 4、安捷倫、安捷倫GC/MS GC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 數(shù)據(jù)標準化和統(tǒng)計學分析 方面：三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學4 4、安捷倫、安捷倫GC/MS GC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 解釋 方面： 安捷倫安捷倫Mass Prof iler Mass Prof iler 專業(yè)軟件的通路分析功能，可以利用專業(yè)軟件的通路分析功能，可以利用已知的或獨特的、用戶基于已有數(shù)據(jù)設定的通路

21、進行解釋，大已知的或獨特的、用戶基于已有數(shù)據(jù)設定的通路進行解釋，大大簡化了這一過程大簡化了這一過程三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學5 5、LC/MS LC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 分析 方面： 以下幾點對代謝譜分析非常重要：以下幾點對代謝譜分析非常重要： 良好的良好的LC LC 和和MS MS 重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正重現(xiàn)性，以便對大量樣品進行比對和校正 卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣卓越的可靠性，最大限度地延長正常運行時間，分析大量樣品品 高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍高靈敏度，能夠檢測復雜樣品中的低水平代謝物，動態(tài)范圍超過超過5 5 個數(shù)量級個數(shù)量級三、發(fā)現(xiàn)代謝組學三、發(fā)現(xiàn)代謝組學5 5、LC/MS LC/MS 在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在發(fā)現(xiàn)代謝組學中的應用在 尋找特征 方面： 安捷倫的安捷倫的MassHunt er LC/MS MassHunt er LC/MS 工作站軟件包含獲得專利的工作站軟件包含獲得專利的分子特征提取算法，專為精確質(zhì)量分子特征提取算法，專為精確質(zhì)量LC/MS LC/MS 飛行時間數(shù)據(jù)而設計，飛行時間數(shù)據(jù)而設計，能夠識別與單一化合物相關的協(xié)變離子。此外，它還能識別和能夠識別與單一