第二章--離心機(jī)的原理及應(yīng)用

1、2021/8/141第二章第二章 離心機(jī)的原理與應(yīng)用離心機(jī)的原理與應(yīng)用 2021/8/142臺(tái)式高、超速臺(tái)式高、超速離心機(jī)離心機(jī)0.6-10萬(wàn)轉(zhuǎn)萬(wàn)轉(zhuǎn)/分分離心機(jī)離心機(jī)制備型制備型分析型分析型分析性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地臺(tái)式（或地面式）普通面式）普通離心機(jī)離心機(jī)大容量冰大容量冰凍離心機(jī)凍離心機(jī)小于小于0.6萬(wàn)萬(wàn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分高速冰凍高速冰凍離心機(jī)離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)萬(wàn)超速冰凍超速冰凍離心機(jī)離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或萬(wàn)或更高更高(分析性超速離分析性超速離心主要用于檢測(cè)心主要用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等降特征和結(jié)構(gòu)等)2021/8/

2、143 1 1常速離心機(jī)常速離心機(jī)2021/8/144 高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1 110104 42 25 510104 4 r rminmin。相相對(duì)離心力達(dá)對(duì)離心力達(dá)1 110104 41 110105 5g g， 主要用于分離各種主要用于分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器等。等。 為了防止高速離心過程中為了防止高速離心過程中溫度升高溫度升高而使酶等生物分子而使酶等生物分子變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)了變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)了冷凍裝置冷凍裝置，稱，稱高速高速冷凍離心機(jī)冷凍離心機(jī)。 2 2高速離心機(jī)高速離心機(jī)2021/8/1453 3超速

3、離心機(jī)超速離心機(jī) 超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速達(dá)超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速達(dá)2.52.510104 48 810104 4 r rminmin，最大相最大相對(duì)離心力達(dá)對(duì)離心力達(dá)5 510105 5g g甚至更高一些。超速離心機(jī)的精密度甚至更高一些。超速離心機(jī)的精密度相當(dāng)高。相當(dāng)高。 分離分離細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、多糖細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等等 為了防止樣品液濺出，一般附有為了防止樣品液濺出，一般附有離心管帽離心管帽； 為防止溫度升高，均有為防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；系統(tǒng)； 為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)。 此外還有一系列

4、此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及各種指示儀表安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及各種指示儀表等。等。 2021/8/1462021/8/147二、離心分離方法的選擇二、離心分離方法的選擇 離心分離的方法可分為離心分離的方法可分為三類三類 1 1差速離心差速離心采用不同的采用不同的離心速度和離心時(shí)間離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的，使沉降速度不同的顆粒分批分離顆粒分批分離的的方法，稱為差速離心。方法，稱為差速離心。操作時(shí)，采用均勻的懸浮液進(jìn)行離心，選擇好離心力和離心時(shí)間，使操作時(shí)，采用均勻的懸浮液進(jìn)行離心，選擇好離心力和離心時(shí)間，使大顆粒先沉降，取出上清液，在加大離心力的條件下再進(jìn)行離心，分大顆粒

5、先沉降，取出上清液，在加大離心力的條件下再進(jìn)行離心，分離較小的顆粒。離較小的顆粒。如此多次離心，如此多次離心，使不同大小的顆粒分批分離使不同大小的顆粒分批分離。2021/8/148 差速離心所得到的沉降物含有差速離心所得到的沉降物含有較多雜質(zhì)，需經(jīng)過重新懸浮和較多雜質(zhì)，需經(jīng)過重新懸浮和再離心若干次，才能獲得較純?cè)匐x心若干次，才能獲得較純的分離產(chǎn)物。的分離產(chǎn)物。 差速離心主要用于分離大小和差速離心主要用于分離大小和密度密度差異較大的顆粒差異較大的顆粒。操作操作簡(jiǎn)簡(jiǎn)單方便單方便，但分離但分離效果較差效果較差。 2021/8/149 舉例： 沉淀沉淀(細(xì)胞膜細(xì)胞膜碎片、線粒體、碎片、線粒體、溶酶體溶

6、酶體)已破碎的細(xì)胞已破碎的細(xì)胞500g,10 沉淀沉淀(細(xì)胞核細(xì)胞核)上清液上清液10 000g,10上清液上清液100 000g,3h 沉淀沉淀(核糖核蛋白體核糖核蛋白體) 上清液上清液(可溶性組分可溶性組分)2021/8/1410 2 2密度梯度離心密度梯度離心 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使密度不同的密度不同的組分得以分離組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。的一種區(qū)帶分離方法。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的梯度介質(zhì)梯度介質(zhì)制成的。制成的。梯度介質(zhì)應(yīng)有梯度介質(zhì)應(yīng)有足夠大的溶解度足夠大的溶解度，以形成

7、所需的密度，不與分離組，以形成所需的密度，不與分離組分反應(yīng)，而且不會(huì)引起分離組分的凝聚、變性或失活。分反應(yīng)，而且不會(huì)引起分離組分的凝聚、變性或失活。2021/8/1411 常用的有常用的有蔗糖、甘油蔗糖、甘油等。使用最多的是等。使用最多的是蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其梯度范圍是：蔗糖系統(tǒng)，其梯度范圍是：蔗糖濃度濃度5 56060，密度密度1.021.021.301.30g/cmg/cm3 3。 密度梯度的制備可采用密度梯度的制備可采用梯度混合器梯度混合器，也可將不同濃度，也可將不同濃度的蔗糖溶液，小心地一層層加入離心管中，的蔗糖溶液，小心地一層層加入離心管中，越靠管底，越靠管底，濃度越高，

8、濃度越高，形成形成階梯梯度階梯梯度。2021/8/1412離心前，把離心前，把樣品樣品小心地鋪放在預(yù)先制備好的小心地鋪放在預(yù)先制備好的密度梯度溶液的表面密度梯度溶液的表面。離心后，不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數(shù)差異的顆粒在離心后，不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶不連續(xù)區(qū)帶。各區(qū)帶內(nèi)的顆粒較均一，分離效果較好。各區(qū)帶內(nèi)的顆粒較均一，分離效果較好。在密度梯度離心過程中，在密度梯度離心過程中，區(qū)帶的位置區(qū)帶的位置和和寬度寬度隨隨離心時(shí)間離心時(shí)間的不同而的不同而改變。改變。隨離心時(shí)間的加長(zhǎng)，區(qū)帶會(huì)因顆粒

9、擴(kuò)散而越來越寬。為此，適當(dāng)隨離心時(shí)間的加長(zhǎng)，區(qū)帶會(huì)因顆粒擴(kuò)散而越來越寬。為此，適當(dāng)增大離心力增大離心力而而縮短離心時(shí)間縮短離心時(shí)間，可以減少區(qū)帶擴(kuò)寬，可以減少區(qū)帶擴(kuò)寬。2021/8/1413 3 3等密度離心等密度離心 將將CsClCsCl2 2、CsSOCsSO4 4等介質(zhì)等介質(zhì)溶液與樣品溶液混合，然后在選溶液與樣品溶液混合，然后在選定的離心力作用下，經(jīng)足夠時(shí)間的離心，銫鹽在離心場(chǎng)定的離心力作用下，經(jīng)足夠時(shí)間的離心，銫鹽在離心場(chǎng)中沉降形成中沉降形成密度梯度密度梯度 樣品中不同浮力密度的顆粒在各自的樣品中不同浮力密度的顆粒在各自的等密度點(diǎn)位置等密度點(diǎn)位置上形上形成區(qū)帶。成區(qū)帶。 常用來分離提取

10、常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。2021/8/1414 前述密度梯度離心法中，欲分離的顆粒未達(dá)到其前述密度梯度離心法中，欲分離的顆粒未達(dá)到其等密度位置，故分離效果不如等密度離心法好。等密度位置，故分離效果不如等密度離心法好。 應(yīng)當(dāng)注意的是，銫鹽濃度過高和離心力過大時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意的是，銫鹽濃度過高和離心力過大時(shí)，銫鹽會(huì)沉淀管底，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成事故，故等密度銫鹽會(huì)沉淀管底，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成事故，故等密度梯度離心需由專業(yè)人員經(jīng)嚴(yán)格計(jì)算確定梯度離心需由專業(yè)人員經(jīng)嚴(yán)格計(jì)算確定銫鹽濃度銫鹽濃度和離心機(jī)轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間和離心機(jī)轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間。 此外，銫鹽對(duì)鋁合金轉(zhuǎn)子有很此外，銫鹽對(duì)鋁合金轉(zhuǎn)子有

11、很強(qiáng)的腐蝕性強(qiáng)的腐蝕性，故最，故最好使用好使用鈦合金轉(zhuǎn)子鈦合金轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)子使用后要仔細(xì)清洗并干，轉(zhuǎn)子使用后要仔細(xì)清洗并干燥。燥。 2021/8/14152021/8/1416三、離心條件的確定三、離心條件的確定 離心分離的效果好壞與諸多因素有關(guān)。除了上離心分離的效果好壞與諸多因素有關(guān)。除了上述的述的離心機(jī)種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度離心機(jī)種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度梯度梯度等以外等以外 確定離心機(jī)的確定離心機(jī)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速和離心和離心時(shí)間時(shí)間 還要注意離心介質(zhì)溶液的還要注意離心介質(zhì)溶液的pHpH值和溫度值和溫度等條件。等條件。 2021/8/1417 1 1離心力離心力 物質(zhì)顆粒在離心場(chǎng)中所受到

12、的物質(zhì)顆粒在離心場(chǎng)中所受到的離心力離心力( (Fc)Fc)的大小，決定于的大小，決定于顆粒的質(zhì)量顆粒的質(zhì)量( (m)m)和和離心加速度離心加速度( (c)c)：Fc=mcFc=mc 離心加速度的大小取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速和顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑：離心加速度的大小取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速和顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑：c=c=2 2r r 式中式中：轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)子的角速度角速度( (radrads)s)；r r：旋轉(zhuǎn)半旋轉(zhuǎn)半徑徑，即顆粒到旋轉(zhuǎn)軸中心的距離，即顆粒到旋轉(zhuǎn)軸中心的距離( (cm)cm)。2021/8/1418若轉(zhuǎn)速以慣用的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)若轉(zhuǎn)速以慣用的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)( (r rmin)min)來表示，則來表示，則=2n/60=2n/

13、60代入上式，得到：代入上式，得到：c =c =2 2r =4r =42 2n n2 2r /3600r /3600式中式中 n n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)( (r rmin)min)。在說明離心條件時(shí)，低速離心通常以轉(zhuǎn)子每分鐘的在說明離心條件時(shí)，低速離心通常以轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)數(shù)表示表示，如，如4000 4000 r rminmin。而在高速離心時(shí)，特別是在超速離心時(shí)，往往用而在高速離心時(shí)，特別是在超速離心時(shí)，往往用相對(duì)離相對(duì)離心力心力來表示。如：來表示。如：65 00065 000g g。2021/8/1419 相對(duì)離心力相對(duì)離心力是指顆粒所受的是指顆粒所受的離心力離心力與與地心引力

14、地心引力( (重力重力) )之比。之比。即即: :RCF=Fc/Fg=4RCF=Fc/Fg=42 2n n2 2r /r /（36003600980.6980.6）g g 將有關(guān)數(shù)字代入上式，化簡(jiǎn)為：將有關(guān)數(shù)字代入上式，化簡(jiǎn)為： RCF=1.12RCF=1.121010-5-5nn2 2rrg g式中式中 RCFRCF：相對(duì)離心力相對(duì)離心力( (g)g)；n n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)( (r rmin)min)；r r：旋轉(zhuǎn)半徑旋轉(zhuǎn)半徑( (cm)cm)；g g：重力加速度，重力加速度，9809806 6 cmcms s2 2 2021/8/1420轉(zhuǎn)速與轉(zhuǎn)速與RFCRFC的換算的換算

15、：便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間：便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，人們?cè)谑降幕A(chǔ)上制作了三者關(guān)系的列的換算，人們?cè)谑降幕A(chǔ)上制作了三者關(guān)系的列線計(jì)算圖線計(jì)算圖半徑半徑相對(duì)離心力相對(duì)離心力轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速方法：三點(diǎn)一線，左對(duì)左，右對(duì)右方法：三點(diǎn)一線，左對(duì)左，右對(duì)右2021/8/14212 2、轉(zhuǎn)子離心管及選擇、轉(zhuǎn)子離心管及選擇 離心管離心管v 玻璃離心管質(zhì)雖硬、但脆，不能承受超離心的壓力。玻璃離心管質(zhì)雖硬、但脆，不能承受超離心的壓力。v 超離心機(jī)離心管：塑料管及不銹鋼管。超離心機(jī)離心管：塑料管及不銹鋼管。v 注意離心管的平衡注意離心管的平衡v 離心時(shí)樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而離心時(shí)樣品

16、一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故產(chǎn)生事故 離心管帽離心管帽v 超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽。戴上管帽。2021/8/14223 3、轉(zhuǎn)子及選擇、轉(zhuǎn)子及選擇 角轉(zhuǎn)子（角轉(zhuǎn)子（TypeType）、水平轉(zhuǎn)子（水平轉(zhuǎn)子（swsw）、）、垂直轉(zhuǎn)子（垂直轉(zhuǎn)子（v v）、）、區(qū)帶轉(zhuǎn)子（區(qū)帶轉(zhuǎn)子（c c）等等 角轉(zhuǎn)子角轉(zhuǎn)子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好角度越大

17、，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。效果差。2021/8/1423 顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一側(cè)離心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”。 最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便但加速或減速最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便但加速或減速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)。時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)。2021/8/1424 水平轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子v旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)從旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)從垂直懸吊上升到水平位置垂

18、直懸吊上升到水平位置（約（約200200800rpm800rpm）時(shí)。）時(shí)。v顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，是沿管子方向的，2021/8/1425 梯度離心中顆粒沉降區(qū)梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶帶橫過離心管橫過離心管，離心后，離心后區(qū)帶不必重新定位區(qū)帶不必重新定位 但只有處于樣品區(qū)帶中但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底心的顆粒才直接向管底沉降，沉降， 其它顆粒則撞向壁的兩其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”，但受振動(dòng)和變速攪亂后但受振動(dòng)和變速攪亂后對(duì)流現(xiàn)象小得多。對(duì)流現(xiàn)象小得多。2021/8/1426 四、四、 離心機(jī)的使用離心機(jī)的使用 離心法是

19、分離沉淀的一種方法。離心法是分離沉淀的一種方法。 它是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力，使比重較它是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力，使比重較大的物質(zhì)沉積在管底，以達(dá)到與液體分離的目大的物質(zhì)沉積在管底，以達(dá)到與液體分離的目的。的。 因液體在沉淀的上部，故稱清亮的液體部分為因液體在沉淀的上部，故稱清亮的液體部分為上清液。上清液。 2021/8/1427 （一）電動(dòng)離心機(jī)的使用方法：（一）電動(dòng)離心機(jī)的使用方法： 1.1.將欲離心的液體，置于將欲離心的液體，置于離心管或小試管離心管或小試管內(nèi)。并檢查離內(nèi)。并檢查離心管或小試管的大小是否與離心機(jī)的套管相匹配。心管或小試管的大小是否與離心機(jī)的套管相匹配。 2.2.取

20、出離心機(jī)的全部套管，并檢查套管底部是否鋪有軟取出離心機(jī)的全部套管，并檢查套管底部是否鋪有軟墊，有墊，有無玻璃碎片或漏孔無玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必須取出，漏孔（有玻璃碎片必須取出，漏孔應(yīng)該用蠟封?。?yīng)該用蠟封?。?。 檢查合格后，將盛有離心液的兩個(gè)試管分別放入套管中，檢查合格后，將盛有離心液的兩個(gè)試管分別放入套管中，然后連套管一起分置于粗天平的兩側(cè)，通過往離心管與然后連套管一起分置于粗天平的兩側(cè)，通過往離心管與套管之間滴加水來套管之間滴加水來調(diào)節(jié)兩邊的重量使之達(dá)到平衡調(diào)節(jié)兩邊的重量使之達(dá)到平衡。 2021/8/1428 3.3.將已平衡的兩只裝有離心管的套管，分別放入離心機(jī)相互將已平衡的兩只裝有離心管的套管，分別放入離心機(jī)相互對(duì)應(yīng)的兩插孔內(nèi)。對(duì)應(yīng)的兩插孔內(nèi)。 蓋上離心機(jī)蓋。打開電源開關(guān)。逐檔扭動(dòng)旋鈕，緩慢增加離蓋上離心機(jī)蓋。打開電源開關(guān)。逐檔扭動(dòng)旋鈕，緩慢增加離心機(jī)轉(zhuǎn)速，直至所需