分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第3章ppt課件

1、中南大學(xué)中南大學(xué) 羅建新羅建新第三章第三章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)生理形狀蛋白質(zhì)相互作用溫度應(yīng)激形狀培育條件藥物作用數(shù)量有限構(gòu)造相對(duì)穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反響生命景象復(fù)雜的調(diào)控第三章第三章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點(diǎn)的分別與分析蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點(diǎn)的分別與分析第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)相互作用的研討蛋白質(zhì)相互作用的研討第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其運(yùn)用 第一節(jié) 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義 蛋白質(zhì)組 pro

2、tein + genome proteome 一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)方式與功能方式闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)方式與功能方式從整體的角度分析、鑒定細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)的從整體的角度分析、鑒定細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、構(gòu)造、性質(zhì)、表達(dá)程度與修飾形狀組成、構(gòu)造、性質(zhì)、表達(dá)程度與修飾形狀了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)絡(luò)聯(lián)絡(luò), ,提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律 一、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義 一、分

3、別純化一、分別純化第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點(diǎn)的分別與分析蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點(diǎn)的分別與分析二、分析鑒定二、分析鑒定一、一、 分分 離離 純純 化化 二破碎細(xì)胞二破碎細(xì)胞 三蛋白質(zhì)混合物的分別方法三蛋白質(zhì)混合物的分別方法 四蛋白質(zhì)分別純化的條件四蛋白質(zhì)分別純化的條件 一選擇資料一選擇資料 目的蛋白質(zhì)的含量目的蛋白質(zhì)的含量 提取蛋白質(zhì)的資料提取蛋白質(zhì)的資料一、分一、分 離離 純純 化化 一選擇資料一選擇資料 一、分一、分 離離 純純 化化二破碎細(xì)胞二破碎細(xì)胞 機(jī)械法機(jī)械法 物理法物理法 化學(xué)法化學(xué)法 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及外形、電離性根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及外形、電離性 質(zhì)、生物學(xué)功能的差

4、別進(jìn)展：質(zhì)、生物學(xué)功能的差別進(jìn)展： 1.根據(jù)溶解度根據(jù)溶解度 2.根據(jù)分子量根據(jù)分子量 透析和超濾透析和超濾 平衡離心平衡離心 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 三蛋白質(zhì)混合物的分別方法三蛋白質(zhì)混合物的分別方法一、分一、分 離離 純純 化化3.3.根據(jù)電荷根據(jù)電荷 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 離子交換層析離子交換層析4.4.根據(jù)蛋白質(zhì)的親和才干根據(jù)蛋白質(zhì)的親和才干 親和層析親和層析一、分一、分 離離 純純 化化四四 蛋白質(zhì)分別純化的條件蛋白質(zhì)分別純化的條件 緩沖液緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑鹽、金屬離子和螯合劑 復(fù)原劑復(fù)原劑 去垢劑去垢劑 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑 外表效應(yīng)外表效應(yīng) 蛋白質(zhì)的環(huán)境要素蛋白質(zhì)的

5、環(huán)境要素 溫度溫度 儲(chǔ)存儲(chǔ)存 一、一、 分分 離離 純純 化化二、分析鑒定二、分析鑒定 三圖像分析技術(shù)三圖像分析技術(shù)四放射性核素標(biāo)志親和標(biāo)簽法四放射性核素標(biāo)志親和標(biāo)簽法五蛋白質(zhì)芯片技術(shù)五蛋白質(zhì)芯片技術(shù)六質(zhì)譜技術(shù)六質(zhì)譜技術(shù) 一一WesternWestern印跡技術(shù)印跡技術(shù) 二二維凝膠電泳2-DE技術(shù)七其它方法七其它方法二、分析鑒定二、分析鑒定一一WesternWestern印跡技術(shù)印跡技術(shù)根本操作步驟：根本操作步驟： 蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反響蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反響 目的蛋白質(zhì)的顯示目的蛋白質(zhì)

6、的顯示western western 印跡根本步驟圖示印跡根本步驟圖示二二維凝膠電泳二二維凝膠電泳2-DE)2-DE)技術(shù)技術(shù) 目前蛋白質(zhì)組研討中最有效的分析鑒定技術(shù)之一目前蛋白質(zhì)組研討中最有效的分析鑒定技術(shù)之一 由兩相組成：由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳第一相：等電聚焦凝膠電泳 ( (根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差別根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差別) ) 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( (根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差別根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差別) )二、分析鑒定二、分析鑒定二、分析鑒定二、分析鑒定2-DE 技術(shù)原理2-DE2-DE分析的根本步驟分析的根本步驟蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解溶解變性變性復(fù)原

7、復(fù)原去除蛋白去除蛋白質(zhì)雜志質(zhì)雜志利用不同利用不同pKpK固定化固定化電解質(zhì)配電解質(zhì)配置不同置不同pHpH范圍的凝范圍的凝膠膠利用軟件利用軟件設(shè)計(jì)配置設(shè)計(jì)配置 第一相電泳(IPGIFE)平衡第二相電泳(SDSPAGE)考馬斯亮考馬斯亮藍(lán)染色藍(lán)染色銀染色銀染色銅染色銅染色樣品制備樣品制備IPGIPG膠制備膠制備雙相電泳雙相電泳染色染色二、分析鑒定二、分析鑒定2-DE2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜獲得的蛋白質(zhì)圖譜二、分析鑒定二、分析鑒定 經(jīng)過2-DE得到的蛋白質(zhì)分別圖譜，需求經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為根底的、具有不同灰度強(qiáng)弱和一定邊境方向的斑點(diǎn)電腦信號(hào)。 ( (三三) )圖像分析技術(shù)圖像分析技術(shù)二、分析

8、鑒定二、分析鑒定 2-DE圖像分析軟件包操作過程： 圖像采集圖像采集斑點(diǎn)檢測(cè)斑點(diǎn)檢測(cè)背景消減背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較圖像內(nèi)及圖像間的比較二、分析鑒定二、分析鑒定 四放射性核素標(biāo)志親和標(biāo)簽法正常細(xì)胞正常細(xì)胞 D0D0親和標(biāo)簽親和標(biāo)簽病理細(xì)胞病理細(xì)胞 D8D8親和標(biāo)簽親和標(biāo)簽混合并消化混合并消化生物素親和純化生物素親和純化液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析丈量?jī)蓚€(gè)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度丈量?jī)蓚€(gè)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度二、分析鑒定二、分析鑒定五蛋白質(zhì)芯片技術(shù)五蛋白質(zhì)芯片技術(shù)二、分析鑒定二、分析鑒定 原理原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)樣品

9、分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和電荷比值量和電荷比值m/em/e的差別確定分子量。的差別確定分子量。 運(yùn)用運(yùn)用 蛋白質(zhì)的序列分析蛋白質(zhì)的序列分析 研討蛋白質(zhì)的修飾研討蛋白質(zhì)的修飾六質(zhì)譜技術(shù)六質(zhì)譜技術(shù)二、分析鑒定二、分析鑒定 七七 其它方法其它方法 EdmanEdman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)多肽的陳列順序降解法測(cè)定蛋白質(zhì)多肽的陳列順序 核磁共振核磁共振NMRNMR、熒光光譜法測(cè)定溶液中蛋白、熒光光譜法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)造質(zhì)分子的構(gòu)造 X X射線衍射分析法、小角中子衍射法測(cè)定晶體蛋射線衍射分析法、小角中子衍射法測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子構(gòu)造等白質(zhì)的分子構(gòu)造等二、分析鑒定二、分析鑒定第三節(jié)第三節(jié)蛋白質(zhì)

10、相互作用的研討蛋白質(zhì)相互作用的研討二、蛋白質(zhì)核酸二、蛋白質(zhì)核酸一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)二蛋白質(zhì)之間的相互作用力二蛋白質(zhì)之間的相互作用力三蛋白質(zhì)相互作用的研討方法三蛋白質(zhì)相互作用的研討方法一蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)相互作用的方式蛋白質(zhì)相互作用的方式一蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)相互作用的方式蛋白質(zhì)相互作用的方式 1.1.蛋白質(zhì)亞基的聚合蛋白質(zhì)亞基的聚合 2.2.交叉聚合交叉聚合 3.3.分子識(shí)別分子識(shí)別 4.4.分子的自我裝配分子的自我裝配 5.5.多酶復(fù)合體多酶復(fù)合體一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)二蛋白質(zhì)之間的相互作用力二蛋白質(zhì)之間的相互作用力 氫鍵氫

11、鍵 范德華力范德華力 疏水鍵疏水鍵 離子鍵離子鍵一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)三蛋白質(zhì)相互作用的研討方法三蛋白質(zhì)相互作用的研討方法 1.酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 2.噬菌體展現(xiàn)噬菌體展現(xiàn) 3.生物傳感芯片質(zhì)譜生物傳感芯片質(zhì)譜 4.定點(diǎn)誘變技術(shù)定點(diǎn)誘變技術(shù) 蛋白質(zhì)親和層析 親和印跡 免疫沉淀 交聯(lián) 酵母雙雜交 噬菌體展現(xiàn) 生物傳感芯片質(zhì)譜 蛋白質(zhì)工程中的定點(diǎn)誘變技術(shù) 一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)研討方法研討方法傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)新技術(shù)新技術(shù) 1. 1.酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) DNA-BD DNA-BD具有與報(bào)告具有與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)特異結(jié)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)

12、控區(qū)特異結(jié)合的功能，合的功能，DNA-ADDNA-AD那么那么具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。報(bào)告基因一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) DNA-BDDNA-BD和和DNA-ADDNA-AD分開時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，只需分開時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，只需當(dāng)兩者在空間上接近時(shí)，才干呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)兩者在空間上接近時(shí)，才干呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的活性。的活性。 只需當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)只需當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)X X與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)Y Y間發(fā)生相互作用時(shí)，間發(fā)生相互作用時(shí)，才干激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)兩者單獨(dú)作才干激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)兩者單獨(dú)作用時(shí)均無此功能用時(shí)均無此功能 。一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸

13、二濾膜結(jié)合二濾膜結(jié)合三甲基化干擾三甲基化干擾四四DNase足紋足紋五核酸五核酸-蛋白質(zhì)雜交蛋白質(zhì)雜交一凝膠滯后實(shí)驗(yàn)一凝膠滯后實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸一凝膠滯后實(shí)驗(yàn)一凝膠滯后實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)志的核酸蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)志的核酸探針特異性結(jié)合，所構(gòu)成的探針特異性結(jié)合，所構(gòu)成的復(fù)合物電泳時(shí)在凝膠中的泳復(fù)合物電泳時(shí)在凝膠中的泳動(dòng)速度比未與蛋白結(jié)合的游動(dòng)速度比未與蛋白結(jié)合的游離探針慢，即表現(xiàn)為相對(duì)滯離探針慢，即表現(xiàn)為相對(duì)滯后后該實(shí)驗(yàn)可以評(píng)價(jià)蛋白與核酸結(jié)該實(shí)驗(yàn)可以評(píng)價(jià)蛋白與核酸結(jié)合的特異性合的特異性二濾膜結(jié)合法二濾膜結(jié)合法 利用硝酸纖維素濾膜不能結(jié)合雙鏈DNA，但可與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，將

14、與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段與游離DNA片段別分開。二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸三甲基化干擾三甲基化干擾 經(jīng)甲基化修飾的DNA探針可以干擾蛋白質(zhì)的結(jié)合。將DNA 甲基化后與蛋白質(zhì)進(jìn)展反響，只需在結(jié)合位點(diǎn)上未被修飾的DNA 片段才干與蛋白質(zhì)結(jié)合。DNADNA探針的末端標(biāo)志探針的末端標(biāo)志及探針的甲基化及探針的甲基化蛋白質(zhì)與甲基化探針的結(jié)合及蛋白質(zhì)與甲基化探針的結(jié)合及 DNADNA蛋白質(zhì)結(jié)合探針的分別蛋白質(zhì)結(jié)合探針的分別結(jié)合物及對(duì)照探針結(jié)合物及對(duì)照探針的化學(xué)切割的化學(xué)切割DNADNA片段的序列測(cè)定片段的序列測(cè)定二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸 用特殊方法將用特殊

15、方法將DNADNA從被修飾的堿基處進(jìn)展切從被修飾的堿基處進(jìn)展切割，并經(jīng)電泳分別，由于未結(jié)合蛋白質(zhì)的割，并經(jīng)電泳分別，由于未結(jié)合蛋白質(zhì)的DNADNA可可在隨機(jī)修飾的位點(diǎn)被切割，而結(jié)合蛋白質(zhì)的在隨機(jī)修飾的位點(diǎn)被切割，而結(jié)合蛋白質(zhì)的DNADNA在結(jié)合位點(diǎn)上未被修飾而不能被切割，由此可在結(jié)合位點(diǎn)上未被修飾而不能被切割，由此可獲得蛋白質(zhì)與核酸定位結(jié)合的信息。獲得蛋白質(zhì)與核酸定位結(jié)合的信息。 三甲基化干擾三甲基化干擾四四DNaseDNase足紋足紋 目前廣泛用于蛋白質(zhì)準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)的研討方法目前廣泛用于蛋白質(zhì)準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)的研討方法 原理：原理： DNase DNase可以隨機(jī)水解核苷酸中的磷酸可以隨機(jī)水解核

16、苷酸中的磷酸二酯鍵，將二酯鍵，將DNADNA切成單核苷酸，而結(jié)合有蛋白切成單核苷酸，而結(jié)合有蛋白質(zhì)的質(zhì)的DNADNA免于免于DNaseDNase的水解。的水解。 二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸五核酸五核酸- -蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)TBETBE緩沖液中緩沖液中DNADNA蛋白質(zhì)雜交蛋白質(zhì)雜交放射自顯影放射自顯影 用于鑒定蛋白質(zhì)與DNA的特異性結(jié)合和確定結(jié)合蛋白質(zhì)的分子量。 根本步驟：蛋白質(zhì)雜交蛋白質(zhì)雜交SDS-PAGESDS-PAGE轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至NCNC膜或膜或NylonNylon膜膜緩慢復(fù)性、封鎖、預(yù)雜交緩慢復(fù)性、封鎖、預(yù)雜交參與同位素標(biāo)志的參與同位素標(biāo)志的DNADNA片段作探針片

17、段作探針多次洗膜多次洗膜二、蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)- -核酸核酸二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的運(yùn)用二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的運(yùn)用一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Database)(Protein Database)一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫一蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫一蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫二蛋白質(zhì)構(gòu)造數(shù)據(jù)庫二蛋白質(zhì)構(gòu)造數(shù)據(jù)庫三蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫三蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫四四DIPDIP數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫一蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫： ebi.ac.uk/swissprot PIR和PSD數(shù)據(jù)庫 / /pir 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 rcsb.