基因工程的基本操作程序精品課件資料講解

1、基因工程的基本操作程序（1 1）目的基因的獲?。┠康幕虻墨@?。? 2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3 3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4 4）目的基因的檢測(cè)與鑒定）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：基因工程基本操作程序主要包括四個(gè)步驟： 提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)挠眠m當(dāng)?shù)?限制酶切限制酶切 一定大小的一定大小的DNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法：基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法：cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法文庫(kù)的構(gòu)建方法-反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄

2、法某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNA合成互補(bǔ)合成互補(bǔ)DNA形成雙鏈形成雙鏈DNA（即（即cDNA）導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接與載體連接cDNA文庫(kù)文庫(kù) 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 （反轉(zhuǎn)錄酶）（反轉(zhuǎn)錄酶）DNA聚合酶聚合酶 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū): : 能能編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼區(qū)非編碼區(qū): : 不能能編碼蛋白質(zhì)的序列不能能編碼蛋白質(zhì)的序列（含基因（含基因表達(dá)的表達(dá)的調(diào)控序列調(diào)控序列）知識(shí)補(bǔ)充：知識(shí)補(bǔ)充：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基

3、因結(jié)構(gòu)能夠能夠編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子叫做外顯子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子叫做內(nèi)含子內(nèi)含子內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子外顯子：能：能編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。非編碼序列：非編碼序列：包括包括非編碼區(qū)非編碼區(qū)和和內(nèi)含子內(nèi)含子基因組文庫(kù)和基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較

4、：文庫(kù)比較：（3）從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法：）從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法：依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的如：根據(jù)基因的核苷酸序列核苷酸序列 基因的基因的功能功能 基因基因在染色體上的位置在染色體上的位置 基因的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性等特性2、利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）PCR技術(shù)：技術(shù)：是一項(xiàng)在生物是一項(xiàng)在生物體外體外復(fù)制特定復(fù)制特定DNA片段片段的核酸合的核酸合成技術(shù)，成技術(shù)，短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。（2）原理：原理：DNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制（3）

5、條件：條件：DNA模板模板 引物（一對(duì)）引物（一對(duì)） 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 Taq酶（耐高溫的酶（耐高溫的DNA聚合酶）聚合酶）緩沖液緩沖液（4）過(guò)程：過(guò)程：變性、退火、延伸變性、退火、延伸三步曲三步曲 變性：變性： 雙鏈雙鏈DNA單鏈單鏈DNA55 60 退火退火：90 95引物與單鏈引物與單鏈DNA模板結(jié)模板結(jié)合合( (堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)) ) 延伸：延伸：70 75 Taq酶酶的作用下，從引的作用下，從引物起始物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸（5）結(jié)果：結(jié)果：每循環(huán)一次，目的基因可增加一倍，每循環(huán)一次，目的基因可增加一倍，呈呈指數(shù)形式（指數(shù)形式（2n）擴(kuò)增。擴(kuò)增。 PC

6、R擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增與與DNA復(fù)制復(fù)制的比較的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原則原則原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場(chǎng)所場(chǎng)所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸模板、能量、模板、能量、DNA聚合酶聚合酶DNA在在高溫變性高溫變性解旋解旋解旋酶解旋酶催化催化體外體外復(fù)制復(fù)制細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定的的DNA聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成形成整個(gè)整個(gè)DNA分子分子3、人工合成法人工合成法如果如果基因比較小基因比較小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可，也可以通過(guò)以通過(guò)DNA

7、合成儀合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。用化學(xué)方法直接人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的目的目的： 使使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且，并且可以可以 遺傳遺傳給下一代；給下一代； 使目的基因能夠使目的基因能夠表達(dá)表達(dá)和和發(fā)揮作用發(fā)揮作用。2、基因表達(dá)載體的基因表達(dá)載體的構(gòu)成及作用構(gòu)成及作用：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)目的基因目的基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子標(biāo)記基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子： 位于基因首端的位于基因首端的一段有特殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷片斷，它是它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的

8、部位聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位；作用：作用：驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：終止子：位于基因尾端的位于基因尾端的一段有特殊結(jié)構(gòu)一段有特殊結(jié)構(gòu)DNA片斷。片斷。作用：作用：使轉(zhuǎn)錄終止使轉(zhuǎn)錄終止標(biāo)記基因：標(biāo)記基因：為了為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)（如（如抗生素抗性抗生素抗性基因基因）。）。注意：注意：?jiǎn)?dòng)子與終止子不同于起始密碼和終止密碼啟動(dòng)子與終止子不同于起始密碼和終止密碼 啟動(dòng)子與終止子啟動(dòng)子與終止子位于位于DNA上，上，是是DNA片段片段，與與基因的基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)轉(zhuǎn)錄有關(guān)。起始密碼和終

9、止密碼起始密碼和終止密碼位于位于mRNA上上， 是是3個(gè)相鄰個(gè)相鄰的堿基的堿基，與，與翻譯翻譯（蛋白質(zhì)的合成）（蛋白質(zhì)的合成）有關(guān)有關(guān)。 克隆載體克隆載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的構(gòu)成：的構(gòu)成： 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片片 段。段。表達(dá)載體表達(dá)載體在克隆載體基礎(chǔ)上在克隆載體基礎(chǔ)上增加增加了了啟動(dòng)啟動(dòng) 子、終止子，子、終止子，啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因?qū)τ谀康幕?表達(dá)必不可少。表達(dá)必不可少。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)維

10、持穩(wěn)定和表達(dá)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程的過(guò)程。2、常用的轉(zhuǎn)化方法：常用的轉(zhuǎn)化方法：（1）導(dǎo)入導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞的方法：的方法： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用最常用）a. 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌：土壤中的一種微生物，自然條件下土壤中的一種微生物，自然條件下感染雙子葉感染雙子葉植物和裸子植物植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。染能力。 b.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：植物受傷時(shí)，傷口處細(xì)胞會(huì)分泌大量植物受傷時(shí)，傷口處細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類化合酚類化合物物，吸引農(nóng)桿菌，吸引農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體以

11、轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的的DNA上上。 目的基因目的基因插入插入Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上上 c. 過(guò)程過(guò)程： 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、有效經(jīng)濟(jì)、有效 基因槍法基因槍法單子葉植物常用單子葉植物常用的方法，的方法，成本較高成本較高。 花粉管通道法花粉管通道法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì) （我國(guó)（我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉）（2）導(dǎo)入導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的方法：的方法： 常用常用方法：方法： 顯微注射法顯微注射法 常用的受體細(xì)胞：常用的受體細(xì)胞： 受精卵受精卵目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物 流程：流程：

12、（3）導(dǎo)入導(dǎo)入微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞的方法：的方法： 原核生物特點(diǎn)：原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少 方法：方法：用用Ca2+（或或CaCl2溶液溶液）處理細(xì)胞）處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)胞胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感感受態(tài)細(xì)胞吸收受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。分子，完成轉(zhuǎn)化。四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、轉(zhuǎn)基因生物、轉(zhuǎn)基因生物DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因（1）方法：方法：DNA分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù)（2）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的基因組基因組DNA.

13、 用用放射性同位標(biāo)記放射性同位標(biāo)記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交與轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因已插入表明目的基因已插入染染 色體色體DNA中。中。2、目的基因、目的基因是否轉(zhuǎn)錄出是否轉(zhuǎn)錄出mRNA（1）方法：方法：分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù)（2）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的mRNA. 用用放射性同位標(biāo)記放射性同位標(biāo)記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與與轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出表明目的基因轉(zhuǎn)錄出 mRN

14、A。3、檢測(cè)目的基因、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)是否翻譯成蛋白質(zhì)（1）方法：方法：抗原抗原抗體雜交抗體雜交 （2）原理：原理： 抗原與抗體的特異性結(jié)合抗原與抗體的特異性結(jié)合（3）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì). 用用針對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)針對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)（抗原）的（抗原）的 抗體（放射性標(biāo)記）抗體（放射性標(biāo)記），與與轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的蛋蛋 白質(zhì)（抗原）雜交白質(zhì)（抗原）雜交，若，若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表表 明目的基因已形成相應(yīng)的蛋白質(zhì)明目的基因已形成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。除了上述除了上述分子水平分子水平的鑒定，有時(shí)還需進(jìn)行的鑒定，有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體個(gè)體

15、生物學(xué)水平生物學(xué)水平的鑒定：的鑒定：比如做比如做抗蟲(chóng)、抗病抗蟲(chóng)、抗病的的接種實(shí)驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；以確定是否有抗性以及抗性的程度；或?qū)驅(qū)蚬こ坍a(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較活性比較，以確定功能是否相同，以確定功能是否相同【特別提示】【特別提示】關(guān)注關(guān)注“操作程序操作程序”中的四個(gè)易混點(diǎn)中的四個(gè)易混點(diǎn)(1)(1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因目的基因 應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。(2)(2)目的基因與載體相連接時(shí)，可能出現(xiàn)目的基因與載體相連接時(shí)，可能出現(xiàn)3種連接種連接 方式方式，如，如目的基因目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因 載體、載體載體、載體載體載體。為了防止目的基因或載。為了防止目的基因或載 體自連，基因工程中體自連，基因工程中常用常用2種不同的限制酶種不同的限制酶對(duì)對(duì) 目的基因和載體進(jìn)行目的基因和載體進(jìn)行切割切割，并保證目的基因，并保證目的基因 的的定向連接定向連接（啟動(dòng)子在其前，終止子在其（啟動(dòng)子在其前，終止子在其 后，保證目的基因正常轉(zhuǎn)錄）后，保證目的基因正常轉(zhuǎn)錄）(3)(3)基因工程基因工程4步曲中，只有步曲中，只有第第3步步“將目的