常用細胞凋亡檢測方法

1、常用細胞凋亡檢測方法更新日期：2009-03-23 受關注度： 324920 哪個強 : 丁香園醫(yī)學搜索引擎 搜狗 有道 百度 谷歌 · 上一篇：細胞凍存、解凍方法與細胞計數(shù) · 下一篇：沒有了 · 挑錯 · 推薦 · 打印 生物 醫(yī)學 藥學 信息 產(chǎn)業(yè) 實驗 機構 人物 論壇, 分子生物學,基因芯片,細胞生物學,神經(jīng)生物學,細胞,分子,基因,研究動態(tài),生物產(chǎn)業(yè),人才,招聘,求職,神經(jīng)科學,生物學,功能基因組學,基礎醫(yī)學,功能蛋白組學,生物信息學,生命科學,生物技術,生物芯片,基因芯片,基因工 一的形態(tài)學檢測1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡 （1）

2、未染色細胞：凋亡細胞的體積變小變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體貼壁細胞出現(xiàn)皺縮變圓脫落 （2） 染色細胞：常用姬姆薩染色瑞氏染色等凋亡細胞的染色質濃縮邊緣化，核膜裂解染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡 一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判的進展情況 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)， DAPI三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光 Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存

3、液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋，終濃度為10ug/ml DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10ug/ml 結果評判：過程中細胞核染色質的形態(tài)學改變分為三期：期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；a期細胞核的染色質高度凝聚邊緣化；b期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體圖1： 3 透射電子顯微鏡觀察 結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結

4、構圖2：；a期細胞核的染色質高度凝聚邊緣化；的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體   二磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內側，但在的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中圖3：Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合將Annexin-V進行熒光素（FITCPE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測的發(fā)生碘化丙啶（propidine iodide

5、，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞 ，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來方法： 1 懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導凋亡的懸浮細胞（0.51×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加

6、AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰消化，洗滌染色和分析同懸浮細胞3 爬片細胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察結果圖4圖5：注意事項： 1 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞2 操作時注意避光，反應完畢后盡快在一小時內檢測  時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮，染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50kbp長的DNA大片段，或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNA ladder）細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在

7、凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成1 大分子染色體DNA片段的測定    的早期,染色體斷裂成為50kbp長的DNA大片段所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行&qu

8、ot;因此，早期產(chǎn)生的50kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場每當電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to lar

9、ge fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-30392 DNA Ladder 測定方法：收獲細胞（1107）沉淀？細胞裂解液？10rpm5min，收集上清？1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h？蛋白K（2.5mg/ml）37°C，2h？1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C過夜？14000rpm15min？最后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer？1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相結果：圖6：參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-55073 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析方法：收集細胞？70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜？PBS洗滌，1000rpm10min？RNase A（0.5mg/ml）37°C消化3