亞慢性毒性試驗(yàn)

1、精品資料毒理學(xué)作業(yè)農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥 為白色粉末，水溶性，表 1 是其對 SD 大鼠的急性經(jīng)口試驗(yàn)結(jié)果,請根據(jù)表中結(jié)果，給出該農(nóng)藥的90 天亞慢性試驗(yàn)的試驗(yàn)方案，以及如何對保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量予以控制。表 12，4-滴鈉鹽原藥對 SD 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物性別劑量（mg/kg）動(dòng)物數(shù)（只）死亡數(shù)（只）LD50 及 95% 可信限（mg/kg）雌21550584（430794 ）46451100055215055雄21550501（344730 ）46452100055215055劑量設(shè)置高劑量為 25%LD50 ，中劑量為 12.5%, 低劑量為 6.3% 。雌性 LD50 為 584mg/

2、kg ，高劑量為 146mg/kg, 中劑量為 73mg/kg, 低劑量為 37mg/kg ； 雄性為精品資料501mg/kg ，高劑量為 125mg/kg ， 63mg/kg, 低劑量為 31mg/kg 。根據(jù) GB15670 農(nóng)藥登記毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的農(nóng)藥急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，2 ，4- 滴鈉鹽原藥的 LD50500mg/kg ，屬于低度農(nóng)藥。因此試驗(yàn)時(shí)選擇 SD 大鼠的 LD50 為 584mg/kg 。農(nóng)藥 2,4- 滴鈉鹽原藥 SD 大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康?; 研究喂飼農(nóng)藥 2,4- 滴鈉鹽原藥對大鼠的亞慢性毒性。方法： 取初斷乳 SD 大鼠 80 只，雌雄各半按照體重隨機(jī)分為 4 組。將

3、 2,4- 滴鈉鹽原藥按146 、 73 、 37mg/kg mg/kg 劑量分別拌入飼料內(nèi)經(jīng)口喂飼染毒 90d。觀察： 大鼠外觀體征、體質(zhì)量、進(jìn)食情況等。在實(shí)驗(yàn)中期和末期采血檢測檢測血液學(xué)。試驗(yàn) 末期檢測血生化指標(biāo)以及尿常規(guī)檢查。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物， 計(jì)算臟器指數(shù)， 并對主要 臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。1 材料和方法1.1 受試物農(nóng)藥 2,4- 滴鈉鹽原藥，白色粉末，水溶性，由某地某農(nóng)藥公司提供。SPF 級初斷乳大精品資料鼠 80 只，雌雄各半，體質(zhì)量 50100 g ，由 XXX 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場提供，動(dòng)物合格證 號為醫(yī)動(dòng)字第 XX-XXXX 號。1.2 飼養(yǎng)與管理SPF 環(huán)境條件

4、下，同組同性別兩只一籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。環(huán)境溫度2125C,相對濕度 40%60%。嚴(yán)格控制晝夜交替。1.3 實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)前將雌、 雄大鼠各半按體重隨機(jī)分為 3 個(gè)劑量組和 1 個(gè)對照組, 每組 20 只,將 2,4- 滴鈉鹽原藥按 146 、 73、37mg/kg mg/kg 劑量分別均勻混入飼料中制成顆粒飼料輻照滅菌 后分別供高、中、低劑量組動(dòng)物食用,連續(xù)每日一次喂養(yǎng) 90d ；對照組給予不加受試物的正 常飼料。1.4 觀察指標(biāo)1.4.1 一般情況 試驗(yàn)期間觀察動(dòng)物的一般情況包括外觀體征和行為活動(dòng)、糞便性狀、食物攝入量及體重變化等。1.4.2 血常規(guī)在實(shí)驗(yàn)中期和末期按常規(guī)方法測定血液學(xué)

5、指標(biāo)1.4.3 血液生化指標(biāo)試驗(yàn)?zāi)┢跈z測血液生化指標(biāo)1.4.5 尿常規(guī)檢查尿常規(guī)測定顏色、pH 值、比重（SG）、尿糖（GLU）、尿蛋白，將尿液離心，并對尿中沉淀物進(jìn)行鏡檢。146 臟器病理精品資料解剖動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎、胃腸、腎上腺、胸腺、腦和卵巢、睪丸等 臟器，觀察大體變化并稱重（胃腸除外），計(jì)算臟器指數(shù)臟器質(zhì)量/體重）X100%。將解剖取得的臟器福爾馬林固定，常規(guī)制片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)的指標(biāo)采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，否則經(jīng)變換后分析。2結(jié)果2.1一般狀況2.2體重變化見表

6、22.3血常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果見表 32.4血生化檢測結(jié)果見表 42.5尿常規(guī)檢查2.5臟器指數(shù)見表 52.6病理組織學(xué)檢杳表 22 , 4 滴原藥大鼠 90 d 亞慢性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量變化情況性別劑 量染毒周數(shù)精品資料(mg/kg 02581013)雌03773146雄03773146表 32 , 4-滴鈉鹽原藥大鼠 90 d 亞慢性毒性試驗(yàn)血液常規(guī)檢驗(yàn)性別齊 U量(mg/kg)RBC/(x10 Hb/(g L-1)L-1)WBC/(x109L-1)GRA/%LYM/%雌性試驗(yàn)0刖3773146雄性試驗(yàn)0刖3773精品資料146精品資料雌性試驗(yàn)0后3773146雄性試驗(yàn)0后3773146表 42, 4

7、-滴鈉鹽原藥大鼠 90 d 亞慢性毒性試驗(yàn)血生化檢測結(jié)果性別AST/(U L-i)劑量(mg/kg)ALT/(U L-i)ALP/(U L-i)BUN/(mmol Li)TP/(g L-i)ALB/(g L-i)雌03773146雄03773精品資料146表 5 臟器指數(shù)%性別劑量 大腦肝臟脾臟心臟肺臟胸腺腎臟 腎上腺 睪丸（卵巢）(mg/kg)雌03773146雄037731463.討論控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量1 大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)技術(shù)因素的質(zhì)量控制1. 1 動(dòng)物臨床觀察指標(biāo)的質(zhì)量控制在藥品臨床前大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究過程中，其臨床觀察指標(biāo)主要包括行為活動(dòng)、 體質(zhì) 量 、 增質(zhì)量 、精品資料飼料生物利用度

8、等 ，而體質(zhì)量 、增質(zhì)量 、飼料生物利用度指標(biāo)均為需要統(tǒng)計(jì)分析的客觀指標(biāo) 。因其貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期 , 數(shù)據(jù)的客觀性與實(shí)驗(yàn)環(huán)境 、給藥過程中 動(dòng)物感受是否舒適 、動(dòng)物密度 、動(dòng)物健康狀況等因素相關(guān) 。在動(dòng)物臨床指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析前 控制體系中 , 實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)選擇 S PF 級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 ;每籠 2 只 ;體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)適應(yīng)環(huán) 境周期 羽周；計(jì)算飼料攝入量每日應(yīng)稱質(zhì)量，每周給藥完畢即計(jì)算大鼠的飼料生物利用 度 ,比較分析各組動(dòng)物飼料生物利用度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 分析產(chǎn)生差異的原因 ,討論差異是否與動(dòng)物自發(fā)性疾病 ( 如大鼠自發(fā)性糖尿病會(huì)引起大鼠飼料生物利用度明顯增大) 有關(guān)同時(shí)應(yīng)排除營養(yǎng)因素或給藥途徑對

9、動(dòng)物的損傷因素；在動(dòng)物行為活動(dòng)指標(biāo)觀察中應(yīng)在每日投藥過程中重點(diǎn)觀察大鼠投藥部位是否發(fā)生充血 、水腫 、嘔血 ,是否發(fā)生動(dòng)物爭斗外傷 皮毛稀疏豎散 、糞便性狀改變等變化 ,并及時(shí)處理與藥物因素?zé)o關(guān)的改變,并詳細(xì)記錄認(rèn)真分析 。1. 2 血液學(xué)樣本的質(zhì)量控制大鼠慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中血液學(xué)常規(guī)的檢測項(xiàng)目主要有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)( R B C ) 、血紅蛋白定量 ( H b ) 、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類計(jì)數(shù) ( WB C+D C ) 、血小板計(jì)數(shù) ( P T ) 、凝血 時(shí)間 ( C T )；血清生物化學(xué)檢測項(xiàng)目主要有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( A S T ) 、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( A L T ) 、堿性磷酸酶 ( A

10、 L P ) 、總蛋白 ( T P ) 、清蛋白 ( A L B ) 、總膽固 醇 ( T -C H O ) 、總膽紅素 ( T - B I L ) 、空腹血糖 ( G L U ) 、尿素氮 ( B U N ) 、肌酐 ( C r ) 。選擇合適的血樣采集法，不僅對動(dòng)物損傷小 、樣本溶血率低 、可重復(fù)采樣等優(yōu) 勢 ,而且使大鼠慢性毒理實(shí)驗(yàn)中分階段檢測藥物對造血系統(tǒng)、生化系統(tǒng)的影響成為可能。1. 3 動(dòng)物病理組織標(biāo)本分析前的質(zhì)量控制 組織病理學(xué)檢查對于判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性靶器官或靶組織具有重要意義。在長期毒理 學(xué)實(shí)驗(yàn)精品資料中有重要地位 , 是評價(jià)藥物毒性的重要依據(jù)。組織病理學(xué)檢查對判斷動(dòng)物的毒性

11、靶器官或靶組織具有重要意義 。實(shí)踐中使用的組織學(xué)檢測前優(yōu)質(zhì)標(biāo)本取材流程可以為 : 根 據(jù)實(shí)驗(yàn)取材項(xiàng)目設(shè)計(jì)表格,需要取得臟器系數(shù)的器官或組織和其他器官或組織分別標(biāo)示于一個(gè)完整的記錄單元中；使用 250 m L 廣口瓶貯存新鮮配制的10%甲醛溶液 180200 m L 備用 ; 對擬取材的大鼠進(jìn)行解剖分組順序編號 ; 大鼠麻醉狀態(tài)下,股動(dòng)脈放血致死-胸腔組織（胸腺、心、肺）T腹腔組織（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲 腸 、直腸 、肝 、脾 、胰腺 、腎上腺 、腎 、卵巢 、子宮 、膀胱 、前列腺 、睪丸 、 附睪）T頸、腦部組織（甲狀腺、腦、垂體、脊髓）。其中胸腺、胰腺、腎上腺、 卵巢 、甲狀腺 、

12、垂體 、脊髓等腺體組織或微小組織應(yīng)使用擦鏡紙或紗布非擠壓式包裹置 于 3. 6% 4. 0% 甲醛 。這樣使浸泡于甲醛溶液中的易混淆臟器在進(jìn)行石蠟包埋時(shí)容易 分辨 ,同時(shí)保證病理組織學(xué)檢查中組織樣本數(shù)目完整；其他組織除大體觀察有明顯病灶的 組織外 ,要求動(dòng)物組織樣本均取自該組織的代表區(qū)。1. 4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的給藥途徑不同而引起的取材質(zhì)量控制因臨床給藥途徑不同 , 在大鼠慢性毒理實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中存在不同的給藥方式, 主要給途徑有主要給藥途徑有灌胃 、直腸 、舌下 、腹腔注射 、肌內(nèi)注射 、皮膚涂抹等。在毒理 學(xué)研究中可能通過對直接接觸藥物部位的檢測結(jié)果分析藥物慢性刺激對直接刺激局部組織 的影響 , 還

13、可以分析藥物吸收和給藥技能合理與否 。2 影響大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的環(huán)境 、動(dòng)物福利 、誤差控制2. 1 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的環(huán)境控制在不同環(huán)境中進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的大鼠 ,對照組和藥物組動(dòng)物均不同程度地存在因環(huán)境所精品資料理與否息息相關(guān)。 樣本固定前的大體解剖觀察處理與組織學(xué)檢查結(jié)果具有直接關(guān)系,取樣以肉眼能觀察到病灶的肺葉和表面觀察正常的肺葉各取一為原則,在同一個(gè)受試動(dòng)物肺組織中不可單一地單純選擇大體觀察異常的小葉或大體觀察正常的小葉樣本 。2. 2 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物福利控制動(dòng)物在毒理學(xué)研究過程中，會(huì)產(chǎn)生緊張 、疼痛 、呼吸困難 、痙攣 、顫抖 、腹瀉 、 孔道出血 、癱瘓 、休克 , 甚至死亡的情況

14、 。因此 ,它們在遇到恐懼或惡劣環(huán)境時(shí) ,生理 和心理都可能患病 ?？刂圃瓌t為實(shí)驗(yàn)人員投藥過程時(shí)間宜短不宜長 , 抓取動(dòng)物輕拿輕放 血清采樣宜快不宜慢 , 盡量提供人為因素影響小的實(shí)驗(yàn)環(huán)境， 要求實(shí)驗(yàn)研究人員具備愛護(hù)動(dòng) 物之心和熟練的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技能并貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期 。2. 3 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的誤差質(zhì)量控制在大鼠慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)誤差主要與樣本的隨機(jī)性 、實(shí)驗(yàn)操作的一致性 、流程的 恒定性有關(guān) 。 抽樣誤差 : 一般情況下 ,慢性毒性實(shí)驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組應(yīng)使用相等數(shù)量的 雌 、雄動(dòng)物 。每組動(dòng)物大鼠至少 20只 。差異應(yīng)不超過平均體質(zhì)量的 20% 。 系統(tǒng)誤 差 。包括下列兩類情況 。實(shí)驗(yàn)技術(shù)熟練

15、因素造成的誤差 :在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中 ,為了真 實(shí)反映外來化合物的毒性 ,除了要統(tǒng)一各種實(shí)驗(yàn)條件外, 每日的給藥時(shí)間應(yīng)一致 。一是可比性強(qiáng) ,二是為了避免錯(cuò)誤而影響其他藥理實(shí)驗(yàn)甚至臨床用藥 。因此 , 應(yīng)將實(shí)驗(yàn)人員的技 術(shù)熟練因素以一定的模式貫穿于各實(shí)驗(yàn)組中 ,在整個(gè)給藥期中給藥人員每天應(yīng)互換給藥的 組別 ,同時(shí)應(yīng)保證給藥時(shí)間的準(zhǔn)確性和一致性；流程造成的誤差控制 : 系統(tǒng)誤差可因分析致的炎性細(xì)胞浸潤或間質(zhì)性肺炎等病理變化,這些變化與實(shí)驗(yàn)環(huán)境級別及日常消毒措施合精品資料方法 、儀器校正錯(cuò)誤 、試劑純度不夠 、檢測者的感觀 、環(huán)境因素改變等因素造成 ;隨機(jī)可能因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中各種隨機(jī)因素的共同作用等因素造成壓變化 - 儀器故障 - 操作技術(shù)差別等 ; 過失誤差可因工作人員不負(fù)責(zé)任（ 器皿不凈 、加 樣錯(cuò)誤 、計(jì)算錯(cuò)誤