抗流感藥物靶點及其抑制劑

1、抗流感藥物靶點及其抑制劑 流感病毒是一種負螺旋單鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科。根據病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基質蛋白（matrix proteins，M1）的抗原決定簇不同，流感病毒被分為三類：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒顆粒結構大致相似（如圖1），自內而外可分成核心、基質蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圓形，長絲狀。甲型和乙型流感病毒核酸有八個RNA節(jié)段，負責編碼十種蛋白，包括血凝素（HA）、神經氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、堿性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基質蛋白（M1）、離子通道蛋白（M2）、非結構蛋白（NS1）、核輸出蛋白（NE

2、P或NS2）。此外，大多數甲型流感病毒還有線粒體靶向的寡聚PB1-F2蛋白1，報道其與細胞凋亡以及病毒毒力有關。這些病毒RNA片段同NP結合并纏繞形成病毒核糖核蛋白體（vRNP），vRNP再與三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）結合形成核糖核苷酸，負責RNA的復制和轉錄，這種結合模式確保了病毒RNA對于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七個RNA節(jié)段?；蚪M分節(jié)段的特點為流感病毒高頻率基因重配提供了條件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包圍，在脂膜上有基質蛋白M1，其是病毒顆粒的主要蛋白，并通過化學鍵結合到vRNP。M2蛋白為具有離子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一種叫做BM2

3、的蛋白可以起到類似M2蛋白作用。病毒最外層的包膜是包裹基質蛋白的磷脂雙分子層，該膜來源于宿主細胞的細胞膜。膜表面具有兩類非常重要的“刺突”，即兩種糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相對簡單，僅有一種HA和一種NA。對于甲型流感，根據病毒表面抗原HA及NA的不同，其可進一步細分為16個HA亞型（H1 H16）、9個NA亞型(N1 N9)2。圖1 甲型流感病毒結構模式圖3三種類型流感病毒的宿主范圍也是有區(qū)別的：甲型流感病毒能夠感染哺乳類動物（人、豬、馬等）和禽類，乙型流感病毒主要在人類和豬間傳播，丙型流感病毒只在人類傳播。另外，三種病毒的變異性及危害性從大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，對

4、人類危害性最大的是甲型流感病毒。流感病毒感染及增殖過程圖2 流感病毒感染及增殖機制4如圖2所示，流感病毒感染及增殖過程可大致分為黏附內吞融合去包膜入核vRNA合成蛋白合成出核組裝出芽釋放等階段。首先，流感病毒包膜表面抗原HA識別并粘附到宿主細胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialic acid，SA）受體上，在粘附階段，神經氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA與氣管上皮細胞粘液層唾液酸的結合，從而強化病毒感染。接著，在受體介導的細胞內吞作用下，結合于宿主細胞表面的病毒進入宿主細胞并形成胞內體（endosome）。胞內體內的低pH條件啟動HA“融合域”構象轉化，導致病毒包膜與胞內體膜發(fā)生融合。與此同時

5、，非糖基化基質蛋白M2離子通道被激活，形成進入細胞內膜的內向質子流，引發(fā)基質蛋白M1與vRNP的解離。然后，vRNP被轉運進入細胞核，啟動病毒遺傳信息的復制和轉錄。RdRP以及NP對流感病毒的轉錄和復制具有重要意義。新合成的NP以及RNA聚合酶也被轉入細胞核，與新和成的vRNA結合形成子代vRNP。在非結構性的核輸出蛋白NEP/NS2及基質蛋白M1介導下，核內形成的子代vRNP被轉運出宿主細胞核進入細胞漿，經裝配形成成熟病毒顆粒。出芽后的新病毒顆粒仍然通過HA-SA鍵吸附于宿主細胞表面，經NA水解SA釋放子代病毒，造成病毒的擴散與傳播5?？沽鞲胁《景悬c及其抑制劑預防和治療流感，通常采用疫苗和抗

6、流感化學藥物。流感病毒不斷地變異，常規(guī)疫苗可能難以預防治療新病毒引發(fā)的流感大爆發(fā)，因此，抗流感化學藥物研究具有非常重要的意義。總的來說，目前的抗流感化學藥物有兩個大的研究方向，分別針對流感病毒本身功能蛋白和宿主細胞潛在靶點?；谒拗鞯目沽鞲胁《景袠思耙种苿┗谒拗鞯目沽鞲胁《景袠税ǖ鞍酌负湍遗葙|子ATP酶以及激酶等，然而這類藥物對于非感染組織的潛在毒性還有待評價。（1）蛋白酶 前體蛋白HA0剪切位點的性質決定了能夠剪切HA0的宿主蛋白酶類型，直接影響病毒嗜組織性和致病力。在高致病性H5和H7禽流感病毒中，HA0剪切位點含有多堿基序列，可被宿主細胞內廣泛存在的堿性氨基酸蛋白酶或者PC6蛋白酶剪

7、切，引起鳥類致死性的全身感染6, 7。然而，在一般的甲型流感病毒中，蛋白酶剪切位點表達的是單個精氨酸殘基，只能被內蛋白酶識別，同時這種蛋白酶僅在鳥類腸道以及鳥類與哺乳動物的呼吸道中表達，極大地限制病毒在宿主體內的傳播8, 9。事實上，如圖3所示，已知的蛋白酶抑制劑，包括萘莫司他（Nafamostat）、卡莫司他（Camostat）等，均對甲、乙型流感病毒表現出較好的體內外選擇性抑制作用5。圖3 蛋白酶及V-ATPase抑制劑（2）囊泡質子ATP酶（V-ATPase） 選擇性V-ATPase抑制劑通過升高前溶酶體內部pH，從而抑制HA從非融合構象向融合構象的轉化，進而實現病毒復制的抑制。針對該靶

8、點的化合物有1994年報道的Norakin（如圖3）。針對流感病毒自身功能蛋白的靶點及抑制劑該類化學藥物根據病毒作用部位不同，可分為三大類，分別針對病毒核心（RdRP、NP）、病毒基質蛋白（M2）、病毒包膜突觸（HA、NA），下面就它們的抑制劑作簡單介紹。（1）RdRP 流感病毒RdRP進化中高度保守，與哺乳動物的RNA聚合酶完全不同，流感病毒RdRP同時具有復制酶和核酸內切酶活性。感染早期階段，RdRP以vRNA為模板合成mRNA，具有轉錄功能；病毒感染晚期，RdRP構象轉變，以vRNA為模板合成互補的cRNA，再以合成的cRNA為模板合成vRNA,從而實現復制功能。RdRP由異三聚的PA、

9、PB1、PB2三個亞基構成，也稱為3P復合體。PB1位于3P復合體的核心，其N端和C端分別與PA亞基的C端、PB2亞基N端相連，形成穩(wěn)定蛋白復合物。PB1亞基通過不同構象結合vRNA或cRNA，分別合成mRNA（或cRNA）、vRNA，從而履行轉錄、復制功能。其構象的轉換也是PB2帽子結合位點與內切酶活性位點激活的一個原因10。如圖4所示，化合物A是近年報道的靶向PB1的化合物，其IC50值為0.5 µM11。PB2亞基具有多重功能。首先，PB2亞基318-483位氨基酸殘基區(qū)域能夠與宿主mRNA引物帽結構結合12，從而啟動轉錄過程。其次，PB2亞基C端678-757位氨基酸殘基區(qū)域

10、存在二重核定位信號（NSL），與RNA聚合酶通過核孔轉運至細胞核內有關。第三，PB2亞基能夠增強聚合酶復合物的穩(wěn)定性，這可能是PB2亞基能夠增強流感病毒對外界溫度適應性的原因13。最后，研究發(fā)現PB2亞基R702、K627分別與病毒宿主選擇性14、致病性15有密切關系。如圖4所示，化合物B為近年報道的靶向PB2的化合物，其抑制A/H3N2的IC50為7.5 µM16。圖4 RdRP的抑制劑PA也是3P復合體一個非常重要的亞基。Yuan17和Dias18分別在Mg2+、Mn2+存在下，獲得了PA亞基N末端的晶體結構，驗證了PA亞基內存在核酸內切酶活性位點，也表明該核酸內切酶具有雙離子介

11、導的作用機制。其次，PA亞基為磷酸化蛋白，1247位氨基酸殘基區(qū)域是其介導蛋白質水解的功能區(qū)，其水解活性與聚合酶活性呈正相關19。再者，PA亞基也能夠與vRNA、cRNA啟動子特異性結合，163178位氨基酸的突變，導致PA亞基與cRNA結合力降低，聚合酶活性的抑制20。另外，PA亞基124139及186247兩個氨基酸殘基區(qū)域存在兩個核定位（NSL）信號，這與PB1亞基穿核運輸及核內聚集相關21。2008年，通過共沉淀結晶的方法，He等22獲得了H5N1亞型AIV的PAC-PB1N蛋白復合物的晶體結構，由于二者相互作用的殘基在甲型流感中高度保守，這為新一代抗流感藥物的設計提供了新靶標。201

12、2年，Muratore23通過虛擬篩選發(fā)現圖 4所示化合物C，其可以干擾PA、PB1蛋白正確結合，其抑制病毒斑形成的ED50為20 µM左右。2013年，Massari24報道了化合物D，也是PAC-PB1N相互作用抑制劑，結構如圖 4所示，其對A/H1N1亞型AIV的EC50一般為20 µM。2014年，Pagano25報道了兩個化合物（如圖 4所示化合物E、F），其抑制A/H1N1亞型AIV的IC50均為1 µM。利巴韋林（Ribavirin）和Favipiravir（T-705）是兩個核苷類的RdRP抑制劑（圖 4），IC50值分別為6.837 µ

13、M、1 µM。前者很早就已上市，是一種廣譜抗病毒藥物，后者目前處于臨床期（日本）。T-705是一種前藥，代謝活化后，通過競爭性結合GTP抑制流感病毒RdRP。與Ribavirin比較，其不影響宿主DNA/RNA的合成，僅輕度抑制宿主次黃嘌呤核苷酸脫氫酶，高劑量下無顯著細胞毒性，安全性更高。同時，T-705對NAI、M2I耐藥病毒株也有效26。因此，T-705是一個具有很大市場潛力的藥物。（2）NP 核蛋白占病毒蛋白總量的30，其N端含有一個RNA結合區(qū)域以及兩個核蛋白-核蛋白相互作用區(qū)域。NP作為結構蛋白組成vRNP，與病毒宿主的特異性也有關，同時，參與病毒復制的多個階段，包括：在雙

14、重核定位信號作用下，vRNP進入宿主細胞核過程；vRNA在宿主細胞核內的合成；通過與PB1和PB2的相互作用對多聚酶活性的調節(jié)；通過與M1/NS2相互作用對vRNP出核的調控。NP含有一種胞漿聚集信號，通過與絲狀肌動蛋白相互作用，導致NP在病毒感染后期滯留在胞漿。2006年，Ye等27完成了對A/WSN/33流感病毒NP晶體結構的解析，揭示了NP尾環(huán)介導的NP聚合。不同亞型的A型流感病毒尾環(huán)的組成氨基酸進化中高度保守，其上30個氨基酸殘基的單個突變就可導致NP聚合能力的完全喪失，因此，尾環(huán)上的結合口袋成為NP靶向抗流感藥物的潛在靶點。2006年，香港大學袁國勇課題組28發(fā)現了名為nucleoz

15、in的小分子化合物，其靶向NP聚集,阻斷NP轉運入核,從而抑制H1N1、H3N2、H5N1亞型AIV的感染，證實了NP可作為抗流感靶點。2012年，丁克課題組29通過對nucleozin的改構，發(fā)現了化合物G（如圖5），其針對各種H3N2、H1N1的IC50值的范圍為0.54.6 M，對金剛烷胺耐藥的A/WSN/33(H1N1)、奧司他韋耐藥的A/WSN/1933(H1N1,274Y)病毒株也有一定效果。該類化合物結構如圖 5所示。圖 5 NP及HA的抑制劑（3）M2 金剛烷胺、金剛乙胺為兩個最具代表性的M2離子通道抑制劑，僅對甲型流感有效。這兩個藥物在臨床上使用多年，耐藥性問題突出。但是，這

16、類藥物能夠促進外呼吸道擴張從而增加攝氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要價值。耐藥毒株氨基酸突變區(qū)結構的進一步闡明，為該類藥物解決耐藥問題提供了機遇30, 31。同時，針對A/M2及BM2蛋白進化高度保守區(qū)HXXXW開發(fā)抑制劑，有望得到對甲型、乙型流感均有效的藥物32。（4）HA 流感病毒進入靶細胞的過程需要酸性環(huán)境的誘導：在胞內體低pH條件下，HA構象改變，前體蛋白HA0經蛋白酶剪切形成HA1和HA2，暴露出隱藏在蛋白中的融合域，即HA2的疏水N端。HA2的N端插入胞內體膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜與胞內體膜融合，病毒基因組通過融合孔進入細胞質。而HAl負責與宿主

17、細胞膜表面的唾液酸受體結合，介導病毒通過胞飲方式進入細胞形成胞內體。靶向HA的抗流感化合物，根據機制不同可分為兩類：一類是阻止HAl與宿主細胞膜表面SA受體結合的黏附抑制劑，這類以fludase（DAS181）為代表，其是一種新型唾液酸酶融合蛋白，目前處于b期臨床（美國）；另一類是阻斷HA2介導的膜融合過程的融合抑制劑（抑制低pH誘導的HA構象轉化），這是人們研究較早的一類抑制劑，包括1997年報道的以BMY-27709為代表的水楊酰胺類、1998年報道的以stachyflin為代表的司他弗林類化合物。該類化合物結構如圖 5所示。（5）NA 1967年，一種神經氨酸酶類似物（DANA）被Mei

18、ndl等合成，然而，其對NA的抑制活性并不顯著，未能應用于抗流感治療。1993年，伴隨著神經氨酸酶晶體結構的解析33，von Itzstein34等對DANA進行了結構改造，除了環(huán)上取代基手性的調整，將DANA母核的4位羥基用堿性的胍基替代，得到了第一個臨床使用的NAI扎那米韋（zanamivir），其對NA的親和力較DANA高100倍。但是，其口服生物利用度低，目前臨床主要使用其吸入劑型。1997年，Kim等35用環(huán)己烯環(huán)替換扎那米韋的吡喃環(huán)，保證環(huán)上取代基空間伸展方向不變情況下，用疏水的3-戊氧基替代扎那米韋母環(huán)6位上連接的甘油基，將強堿性胍基用氨基替代，得到了奧司他韋（Oseltamiv

19、ir）。該化合物于1999年被FDA批準用于臨床。其能有效抑制流感病毒，同時，相對于扎那米韋，其口服生物利用度大大提升，固體口服給藥途經增加了患者的依從性，是目前使用最廣的NAI35,這也導致了其耐藥性積累速度最快。目前臨床使用較少的NAI還有在日本應用的帕拉米韋（Peramivir）以及拉尼那米韋（Laninamivir），其中拉尼那米韋屬于目前唯一長效NAI。對于奧司他韋耐受，又不能噴霧吸入扎那米韋的患者，可以考慮靜脈注射帕拉米韋；現有研究表明對于奧司他韋耐藥的毒株，拉尼那米韋依然有效，同時拉尼那米韋一天只需服用一次，使得患者依從性更好36。目前，從人、豬、禽類中分離的NAI耐藥病毒株，包

20、括了除N4亞型之外所有甲型流感病毒亞型以及乙型流感病毒。在流行的高致病性N1亞型（如H1N1、H5N1等）中，奧司他韋耐受問題最普遍，H274Y突變是導致其耐受的主要原因37。常見的N2亞型（主要為H3N2）耐藥突變?yōu)镋119V、R292K突變，但是H274Y突變并不能導致N2亞型對奧司他韋的耐藥37, 38。乙型流感病毒對扎那米韋的耐藥與R152K突變有關39，對奧司他韋的耐藥與R317K突變相關40。圖 6列出了奧司他韋與NA催化區(qū)（以N8為例）結合模式，我們將結合區(qū)分為4個亞位點。2002年，Hanessian41將奧司他韋母環(huán)5位氨基用乙烯基取代，成功得到了化合物H（Ki = 45 n

21、M，本節(jié)所有討論的NAI結構見圖 8），探討了NA催化區(qū)2號亞位點發(fā)生疏水相互作用而非電荷相互作用的可能性。2012年，Bhatt42繼續(xù)對該位點改造，通過羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的對比，發(fā)現還是羥基取代（化合物I）的活性最高(IC50 = 0.32 µM)。通過Hanessian和Bhatt的工作，我們發(fā)現NA催化區(qū)2號亞位點的氫鍵相互作用對于NAI的活性非常重要。圖 6 奧司他韋與N8催化區(qū)結合模式圖在系統(tǒng)分類中，甲型流感病毒NA可分為兩大類，類（Group 1）包括N1、N4、N5、N8四種亞型，類（Group 2）包括N2、N3、N6、N7、N9五種亞型。2006年，

22、隨著Russell43等對N1、N4、N8的結構解析，人們發(fā)現：類NA催化區(qū)2號亞位點附近連接著開放的“150腔”；然而，類NA中“150-LOOP”處于封閉構象，使得類NA活性結合區(qū)旁邊不存在該“150腔”，如圖 7所示。“150腔”的發(fā)現為設計選擇性的類NA抑制劑、解決病毒耐藥問題提供了新思路。Pinto課題組44以奧司他韋為先導化合物，用帶羥基側鏈的三氮唑替換奧司他韋骨架5位上的氨基，得到了以化合物J為代表的類選擇性的NAI（Ki = 1.510-9 4.610-10 M）。2013年，Kerry 45通過化合物的共晶體結構，驗證了化合物J同時占據NA催化區(qū)和“150腔”，是一種雙位點抑

23、制劑。2014年，在對奧司他韋母環(huán)5位氨基進行異硫脲取代時，Pinto課題組意外得到了螺環(huán)化合物K（如圖 8），其對HK1流感病毒的有效濃度為10-610-7 M。N8與化合物K的共結晶結構表明，化合物上螺環(huán)在催化區(qū)偏向150-LOOP，有利于“150腔”的形成，這為開發(fā)雙位點抑制劑提供了一種思路46。圖 744 A.奧司他韋與N1結合模式；B.奧司他韋與N9結合模式為了克服不利的藥動學性質引發(fā)的耐藥問題，Schade47也對奧司他韋母環(huán)5位氨基的取代進行了探討。利用生物電子等排體和前藥的設計原理，成功得到了藥動學性質和口服生物利用度比較理想，同時對奧司他韋耐藥的H1N1突變株有效的化合物L，

24、其活化代謝物抗H1N1的IC50 = 14.5 nM。除了對奧司他韋母環(huán)5位氨基的結構改造，Cheng48用磷酸基和磷酸酯將母環(huán)1位上羧基替換，成功得到了化合物M，其能夠在納摩水平甚至皮摩水平抑制多種流感病毒復制，包括H274Y耐藥毒株。開發(fā)抗流感病毒不可逆抑制劑也是解決當前耐藥問題的一種思路。2013年，Kim49通過對神經氨酸酶催化過渡態(tài)的研究，設計合成了以化合物N為代表的一系列，-二氟取代的化合物。這些化合物能夠與神經氨酸酶催化區(qū)Tyr406形成短暫的共價中間體，廣譜強效抑制流感病毒，包括扎那米韋和奧司他韋耐藥毒株。在動物實驗中，藥效與上市藥物相當或者優(yōu)于上市藥物。圖 8 上市及最新報道

25、的NAI總的來說，對于NAI日益嚴重的耐藥問題，人們將大量關注集中于奧司他韋母核5位上的氨基的改構，母核1位羧基改構及不可逆抑制劑設計也有零星的探討；NA催化區(qū)2號亞位點旁邊“150腔”的發(fā)現與結構解析，也為人們解決NAI的耐藥問題提供了新思路。參考文獻1 Chanturiya A.N., Basanez G., Schubert U., et al. PB1-F2, an influenza A virus-encoded proapoptotic mitochondrial protein, creates variably sized pores in planar lipid memb

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