Notch信號通路在缺血再灌注條件下腸粘膜上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用--楊樺

1、Notch 信號通路在缺血再灌注條件下腸粘膜上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用 陳國慶，張治草，程應東、肖衛(wèi)東，邱遠，王文生，杜廣勝，古應超，李祥生，楊樺*通訊作者摘要：目的：明確Notch信號通路在腸道缺血再灌注條件下腸粘膜上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用。方法：建立雄性C57BL/6小鼠的腸道缺血再灌注動物模型，12h后取腸組織標本。TUNEL方法檢測腸粘膜上皮細胞的凋亡水平。Realtime-PCR及Western-blot方法檢測腸粘膜上皮細胞Notch信號通路各組分的表達變化。建立體外IEC-6細胞的缺氧/復氧細胞模型，通過阻斷劑DAPT及siRNA技術明確Notch信號通路在腸粘膜上皮細胞凋亡中的作

2、用。結(jié)果：腸缺血再灌注后，小鼠腸粘膜上皮細胞的凋亡水平明顯升高，與此同時腸粘膜上皮細胞內(nèi)Notch信號通路Jagged1、DLL1、Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表達水平均明顯升高。在體外IEC-6細胞的缺氧/復氧模型中，缺氧/復氧刺激促進了IEC-6細胞的凋亡，而阻斷Notch信號通路的表達后，IEC-6細胞的凋亡水平進一步明顯升高。結(jié)論：在腸道缺血再灌注條件下腸粘膜上皮細胞中的Notch信號通路被激活，發(fā)揮抑制腸粘膜上皮細胞凋亡的作用。1.前言腸道的缺血再灌注損傷（Ischemia reperfusion injury, I/R）可導致全身炎癥反應綜合征、膿毒血癥及多臟器功能障礙綜

3、合征。腸道是多臟器功能障礙綜合征的“發(fā)動機”，而腸粘膜屏障功能的損傷被認為是其內(nèi)在的始發(fā)事件1。既往研究已明確，腸道I/R可導致腸粘膜上皮細胞的凋亡，進而引起腸粘膜屏障功能的損傷2-4。信號通路PI3K/AKT，ERK1/2及HIF-1通路均參與了腸道I/R導致的腸粘膜上皮細胞的凋亡5-7。但是腸道I/R條件下腸粘膜上皮細胞凋亡的調(diào)控機制仍未完全明確。 既往研究明確，Notch信號通路在腸粘膜上皮穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要調(diào)控作用8。在哺乳動物中，Notch信號通路組分有四種Notch受體（Notch1-4）、五種配體（Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4）9,10。配體與細

4、胞膜表面的Notch受體相互結(jié)合，激活了Notch受體的酶切反應，Notch受體釋放酶切后的活性片段NICD進入胞漿，NICD由胞漿進入胞核形成轉(zhuǎn)錄激活復合物，并激活相應的目的基因Hes家族及Hey家族基因11。分泌酶參與了Notch受體的酶切反應，抑制分泌酶的活性可抑制Notch受體的激活12。 研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟的I/R損傷中，Notch2-Hes5信號通路具有抑制I/R損傷導致的肝臟細胞凋亡的作用13。另外，Notch信號通路可抑制損傷導致的心肌細胞、內(nèi)皮細胞和淋巴細胞的凋亡14-16。Notch信號通路還可抑制I/R損傷導致的神經(jīng)細胞及間質(zhì)細胞的凋亡17,18。腸道缺血再灌注損傷后，腸粘

5、膜上皮細胞發(fā)生增殖及凋亡反應2-4。在此前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)腸道I/R損傷可導致腸粘膜上皮Notch信號通路的激活，參與了I/R損傷后腸粘膜上皮細胞的增殖19。然而，Notch信號通路是否參與了腸I/R損傷后腸粘膜上皮細胞的凋亡，尚不明確。本研究擬明確，腸道I/R損傷后Notch信號通路在腸粘膜上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用。2、材料與方法2.1 實驗動物 本研究中使用C57BL/6小鼠、6-8周齡、雄性，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心。所有小鼠隨機分為2組，對照組（n=7）及I/R實驗組（n=7）。腸I/R小鼠模型的建立方法為微創(chuàng)血管夾夾閉腸系膜上動脈20min，之后松開血管夾關閉腹壁切口，

6、12h后處死動物，取空腸組織備用19。2.2 細胞培養(yǎng) 腸粘膜上皮細胞IEC-6購買于美國ATCC公司。IEC-6培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，100ug/ml鏈霉素及100IU/ml青霉素。細胞貼壁后繼續(xù)于常氧條件（20%O2,5%CO2）或缺氧條件下（1%O2，5%CO2）。需要阻斷Notch通路激活時，培養(yǎng)基中加入DAPT干預12h，此后流式細胞學技術檢測IEC-6細胞的凋亡水平。2.3 Real-time PCR實驗 Trizol法提取腸粘膜的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后保存?zhèn)溆?2。在體內(nèi)實驗中，具體引物序列如下：Jagged1，正義鏈, 5'-CTTGGGTCT

7、GTTGCTTGGTGA-3' 反義鏈, 5'-ACATTGTTGGTGGTGTTGTCCTC-3' DLL1 正義鏈, 5'-CGGCTTCTATGGCAAGGTCTG-3' 反義鏈, 5'-TGTAGCCTCCGTCAGGGTTATCT-3' Notch2 正義鏈, 5'-GCGAGCACCCATACCTGACA-3' 反義鏈, 5'-TGGGCTGGTGGTCACATCTG-3' Hes5 正義鏈, 5'-AAGCTGGAGAAGGCCGACA-3' 反義鏈, 5'-CAGGA

8、GTAGCCCTCGCTGTAGT-3' GAPDH 正義鏈, 5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCA-3' 反義鏈, 5'-AGGTGGAAGAGTGGGAGTTGC-3'.在體外研究中，具體引物序列如下：Jagged1 正義鏈, 5'-CGCCGTGCCCTTTGTGGAG-3' 反義鏈, 5'-GGGCCAGACTGCAGGATAAAC-3' DLL1 正義鏈, 5'-AGAGGGGCCAACGCTACATGTG-3' 反義鏈, 5'-GGCGGAGGCTGGTGTTTCTG-3

9、9; Notch2 正義鏈, 5'-GGGGGGACCTGCTCTGACTAC-3' 反義鏈, 5'-ACGTGCCGCCATTGAAACAGGAG-3' Hes5 正義鏈, 5'-GAAGCCGGTGGTGGAGAAG-3' 反義鏈, 5'-CGGCGAAGGCTTTGCTGTG-3' GAPDH 正義鏈, 5'-GGGGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3' 反義鏈, 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'Real-time PCR的具體反應條件為：94°C反應10

10、 min, 94°C持續(xù)30s, 60°C持續(xù)30s, 72°C持續(xù)45s，反應45循環(huán)。2.4 Western blot實驗 RIPA法提取組織及細胞的總蛋白，bradford法檢測蛋白總濃度，保證電泳膠上樣總量一致，電泳完成后蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1h，4°C冰箱孵育一抗過夜。相關一抗如下：NICD2 (ab-52302, Abcam, 美國), Hes5 (sc-25395, Santa Cruz, 美國), GAPDH (sc-32233, Santa-Cruz,美國)，一抗孵育完成后室溫下孵育相應二抗1h，曝光顯色，并利用

11、柯達凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析（carestream，美國）。2.5 siRNA法干擾細胞Hes5表達 在體外研究中，為了阻斷IEC-6細胞內(nèi)Notch信號通路，我們采用了siRNA干擾技術抑制IEC-6細胞Hes5的表達水平。SiRNA干擾序列購買自廣州銳博公司，Hes5相應的siRNA序列如下：siRNA1, 正義鏈5' GCAUUGAGCAGCUGAAACU dTdT 3' 反義鏈3' dTdT CGUAACUCGUCGACUUUGA 5' siRNA2, 正義鏈5' GCAGAUGAAGCUGCUUUAC dTdT 3'反義鏈 3&#

12、39; dTdT CGUCUACUUCGACGAAAUG 5'。 IEC-6細胞培養(yǎng)于6孔板，鋪滿板底約50%-60%時進行siRNA干擾實驗，干擾siRNA濃度為50nmol，按照操作說明，對照siRNA（si-NC）作為陰性對照組19。干擾6h后，吸除干擾試劑，替換為正常IEC-6細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，提取細胞總蛋白進行后續(xù)的Western blot實驗，或者流式細胞學技術檢測IEC-6細胞的凋亡水平變化。2.6 TUNEL法檢測上皮細胞的凋亡 腸組織標本固定于4%多聚甲醛，制備5um厚度切片，TUNEL試劑盒（羅氏，德國）檢測腸上皮細胞的凋亡水平變化。按照操作說明，室溫下切

13、片浸泡于20ug/ml蛋白酶K15min，0.1%濃度TritonX-100孵育8min，PBS沖洗，3%雙氧水浸泡切片滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后切片標本表面滴加50ulTUNEL試劑，37°C孵育60min，PBS沖洗后熒光顯微鏡下觀察顯色情況，之后行DAB顯色，蘇木素復染，光學顯微鏡下觀察陽性染色細胞。 在體外實驗中，我們采用流式細胞學技術檢測IEC-6細胞的凋亡水平。按照此前的操作方法，IEC-6細胞培養(yǎng)或干預后，行FITC-Annexin V及PI雙染，流式細胞儀檢測細胞的凋亡水平34。2.7統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均為均數(shù)±標準差。兩組間的均數(shù)比較采用Stud

14、ents 檢測，多組間的均數(shù)比較采用ANOVA檢測。所有的統(tǒng)計學分析均采用SPSS13.0完成，p<0.05具有統(tǒng)計學差異。3.結(jié)果3.1 腸道缺血再灌注促進了腸粘膜上皮細胞的凋亡 通過阻斷腸系膜上動脈20min，我們建立了小鼠的I/R動物模型，12h后取空腸組織備用，TUNEL法檢測腸粘膜上皮細胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，腸道I/R明顯促進了腸粘膜上皮細胞的凋亡（圖1 A/B）。統(tǒng)計分析表明，I/R組腸上皮細胞的凋亡水平是對照組的18.7倍（圖1B），陰性對照組無陽性染色細胞（圖1A）。圖1.腸道I/R損傷促進了腸粘膜上皮細胞的增殖。A.陽性染色細胞（DAB棕色）主要位于腸粘膜上皮（

15、15;200），右側(cè)為左側(cè)矩形框內(nèi)的放大圖片（×400）。B.I/R組腸粘膜上皮細胞凋亡明顯增生，*與對照組相比P<0.01。3.2 腸道I/R激活了腸粘膜上皮內(nèi)的Notch信號通路 既往研究明確，在小鼠腸粘膜上皮細胞內(nèi)主要表達的Notch信號通路組分包括：4種配體（Jagged1，Jagged2，DLL1，DLL4），4種受體（Notch1-4），4種Hes下游基因（Hes1，Hes5，Hes6，Hes7）20。我們首先采用了Real-time方法篩查Notch信號通路基因的表達水平變化，結(jié)果表明I/R促進了腸粘膜上皮Jagged1，DLL1，Notch2及Hes5表達，與對

16、照組相比較，分別升高了2.40倍、1.85倍、1.93倍及3.30倍（圖2A，P<0.01）。 接下來，我們檢測了相應基因的蛋白表達水平。統(tǒng)計學分析表明，I/R腸粘膜上皮細胞內(nèi)Hes5及NICD2蛋白表達水平分別是對照組的3.25及2.30倍（圖2B/C，P<0.01）圖2.腸I/R促進了腸粘膜上皮內(nèi)Notch信號通路mRNA及蛋白的表達。A.建立I/R小鼠模型，取腸粘膜提取總RNA，行Real-time PCR檢測。I/R促進了腸粘膜上皮內(nèi)Jagged1，DLL1，Notch2，Hes5的mRNA表達水平，*與對照組比較P<0.01。B. Western blot方法檢測腸

17、粘膜上皮NICD2及Hes5表達水平。C.半定量分析Western blot結(jié)果，I/R促進了腸粘膜上皮NICD2及Hes5表達水平，*與對照組比較P<0.01。3.3 DAPT促進了IEC-6細胞的凋亡 為了明確Notch2信號通路在腸粘膜上皮細胞中的調(diào)控作用，我們建立了體外IEC-6細胞的缺氧復氧模型（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）21。 首先，我們驗證了IEC-6細胞的H/R模型能否模擬體內(nèi)的腸道I/R動物模型。給予IEC-6細胞H/R刺激后，我們提取了IEC-6的總RNA，Real-time PCR結(jié)果表明H/R刺激促進了IEC-6細胞Notch信號通路mR

18、NA的表達。與對照組相比，H/R組IEC-6細胞Jagged1、DLL1、Notch2、Hes5的mRNA分別升高了1.92倍、3.93倍、1.81倍、5.84倍（圖3A，P<0.01）。Western blot結(jié)果表明H/R刺激促進了IEC-6細胞Notch信號通路蛋白的表達，與對照組相比，H/R組的NICD2及Hes5分別升高了1.65、4.42倍（圖3B/C，P<0.01）。上述結(jié)果表明，H/R條件下IEC-6細胞可以模擬體內(nèi)腸道I/R動物模型。 圖3.H/R刺激促進了IEC-6細胞Notch信號通路mRNA及蛋白的表達。A.H/R促進了IEC-6細胞Jagged1、DLL1

19、、Notch2、Hes5的mRNA表達，*與對照組比較P<0.01。B/C.H/R促進了IEC-6細胞NICD2、Hes5的蛋白表達，*與對照組比較P<0.01。 DAPT可以特異性抑制分泌酶從而抑制Notch信號通路的激活。本研究中，我們給予IEC-6細胞DAPT干預以觀察Notch信號通路表達對腸上皮細胞凋亡的影響。Western blot結(jié)果表明DAPT明顯抑制了IEC-6細胞內(nèi)NICD2及Hes5的蛋白表達（圖4A/B）。此后，流式細胞學結(jié)果表明，H/R刺激促進了IEC-6細胞的早期凋亡和晚期凋亡（圖4C），而且在H/R條件下，DAPT進一步促進了IEC-6細胞的凋亡，尤其

20、是早期凋亡（圖4C）。上述結(jié)果表明，在H/R條件下，抑制Notch信號通路表達可進一步促進腸上皮細胞的凋亡。相反的，在腸I/R條件下，Notch2-Hes5信號通路的激活，具有抑制腸粘膜上皮細胞凋亡的作用。圖4.DAPT抑制了Notch信號通路的表達，促進了IEC-6細胞的凋亡。A/B.DAPT(20uM)抑制了IEC-6細胞NICD2/Hes5的表達，半定量分析表明差異具有統(tǒng)計學意義，*與對照組比較P<0.01。C.流式細胞學技術檢測IEC-6細胞的凋亡水平，H/R條件下DAPT明顯促進了IEC-6細胞的凋亡。FITC-Annexin V+/PI+表示晚期凋亡；FITC-Annexin

21、 V+/PI表示早期凋亡；FITC-Annexin V/PI 表示正常細胞。3.4 siRNA技術抑制Hes5表達促進了IEC-6細胞的凋亡 為了進一步驗證Notch信號通路對IEC-6細胞凋亡的影響，我們利用siRNA技術抑制了IEC-6細胞的Hes5表達，觀察IEC-6細胞的凋亡水平變化。Western blot結(jié)果表明，siRNA技術明顯降低了Hes5的表達（圖5A/B）。在H/R條件及常氧條件下，siRNA技術抑制Hes5表達，流式細胞學觀察IEC-6細胞的凋亡水平變化。結(jié)果表明，siRNA技術抑制Hes5表達促進了IEC-6細胞的凋亡；而且在H/R條件下，siRNA技術抑制Hes5表

22、達進一步促進了IEC-6細胞的凋亡，尤其是早期凋亡（圖5C）。上述結(jié)果表明，在H/R條件下Hes5表達具有抑制腸粘膜上皮細胞凋亡的作用。圖5. siRNA技術抑制Hes5表達促進了IEC-6細胞的凋亡。A/B. Western blot結(jié)果表明siRNA技術抑制了IEC-6細胞Hes5表達，半定量分析表明差異具有統(tǒng)計學意義，*與對照組比較P<0.01。C.流式細胞學結(jié)果表明siRNA技術抑制Hes5表達促進了IEC-6細胞的凋亡。FITC-Annexin V+/PI+表示晚期凋亡；FITC-Annexin V+/PI表示早期凋亡；FITC-Annexin V/PI 表示正常細胞，*與對照

23、組比較P<0.01。4.討論 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腸道I/R損傷促進了腸粘膜上皮細胞的凋亡。在腸I/R條件下，腸粘膜上皮Notch信號通路mRNA及蛋白表達水平升高，而且激活的NICD2/Hes5信號通路抑制了I/R對腸粘膜上皮細胞的損傷作用。 創(chuàng)傷、出血及其他的急性應激均可導致腸道的I/R損傷，腸粘膜上皮細胞出現(xiàn)壞死、凋亡，最終導致腸粘膜屏障的損傷。其中，腸粘膜上皮細胞的凋亡是導致腸粘膜屏障損傷的非常重要的因素。早期反應基因，如c-fos、c-jun參與了腸粘膜上皮細胞的凋亡22,23。其他的信號通路及因子如p38 MAPK, IL-6, HGF, KGF均參與了腸I/R條件下腸粘膜上

24、皮細胞凋亡的調(diào)控24-27。然而，腸道I/R條件下腸粘膜上皮細胞凋亡的調(diào)控機制仍不完全明確。 Notch信號通路在腸粘膜穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要的調(diào)控作用8?；虺聊琋otch信號通路可抑制腸粘膜上皮細胞的正常分化，分泌酶阻斷劑抑制Notch信號通路的激活可影響腸粘膜的穩(wěn)態(tài)28-30。既往研究表明，在腸道缺血再灌注后1h-6h內(nèi)腸粘膜上皮細胞出現(xiàn)明顯增殖反應，6h后腸粘膜TUNEL陽性染色細胞明顯增多22,23,31。我們此前的研究表明，在腸道I/R損傷1h-6h內(nèi)Notch信號通路參與了腸I/R后腸粘膜上皮細胞的增殖19,32。然而，在此前的研究中，我們未研究在腸道I/R損傷6h之后Notch信

25、號通路的表達情況及其在腸粘膜上皮細胞凋亡調(diào)控中的作用。 在本研究中，我們首先利用Real-time PCR技術篩查了腸粘膜上皮細胞Notch信號通路組分的表達變化。生理條件下，Jagged1、DLL1正常表達于腸粘膜上皮細胞20,33。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腸I/R促進了腸粘膜上皮Jagged1、DLL1的表達，Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表達水平同樣升高明顯，這說明腸道I/R損傷后腸粘膜上皮內(nèi)Notch2-hes5信號通路是激活的。與此同時，TUNEL染色表明腸道I/R明顯促進了腸粘膜上皮細胞的凋亡。我們接下來的研究將明確二者之間的內(nèi)在聯(lián)系。 我們建立了體外培養(yǎng)IEC-6細胞缺氧-復氧

26、模型，模擬體內(nèi)的腸道I/R動物模型。Notch信號通路阻斷劑DAPT及siRNA干擾阻斷Hes5表達研究均表明，Notch2-Hes5信號通路具有抑制腸粘膜上皮細胞凋亡的作用，尤其是在H/R刺激條件下。上述研究表明，Notch2-Hes5信號通路參與了腸道I/R損傷后腸粘膜上皮細胞凋亡的調(diào)控作用。接下來的研究中，我們將進一步深入明確腸道I/R損傷后腸粘膜上皮細胞凋亡的具體調(diào)控機制。參考文獻1. Deitch, E.A.; Xu, D.; Lu, Q. Gut lymph hypot Hesis of early shock and trauma-induced multiple organ d

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