檢出限、校準(zhǔn)曲線、空白值

1、檢出限、測(cè)定限、最佳測(cè)定范圍、校準(zhǔn)曲線及分析空白第一節(jié)：檢出限1. 檢出限為某特定分析方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中檢出待測(cè)物質(zhì)的最小濃 度或最小量。所謂“檢出”是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高于空白 的待測(cè)物質(zhì)。檢出限除了與分析中所用試劑和水的空白有關(guān)外，還與儀器的穩(wěn)定性及 噪聲水平有關(guān)。在靈敏度計(jì)算中沒有明確噪聲的大小，因而操作者可以將檢 測(cè)器的輸出信號(hào)，通過(guò)放大器放到足夠大，從而使靈敏度相當(dāng)高。顯然這是 不妥的，必須考慮噪聲這一參數(shù)，將產(chǎn)生兩倍噪聲信號(hào)時(shí)，單位體積載氣或 單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的組分量稱為檢出限。則：D = 2N / S式中：N-噪聲（mV或A）;S- 檢測(cè)器靈敏度；D

2、- 檢出限，其單位隨 S 不同也有三種：Dg=2N / Sg, 單位為 mg/mlDv=2N / Sv, 單位為 ml/mlDt=2N / St, 單位為 g/s有時(shí)也用最小檢測(cè)量（MDA或最小檢測(cè)濃度（MDC作為檢測(cè)限。它們分別是產(chǎn)生兩倍噪聲信號(hào)時(shí)，進(jìn)入檢測(cè)器的物質(zhì)量（g）或濃度（mg/ml）。不少高靈敏度檢測(cè)器，如 FID、NPD ECD等往往用檢出限表示檢測(cè)器 的性能。靈敏度和檢出限是兩個(gè)從不同角度表示檢測(cè)器對(duì)測(cè)定物質(zhì)敏感程度的 指標(biāo)，前者越高、后者越低，說(shuō)明檢測(cè)器性能越好。從而可見，測(cè)量方法的檢出限于分析空白值、精密度、靈敏度密切相關(guān)。 他是分析方法的一個(gè)綜合性的重要計(jì)量參數(shù)。2. 檢

3、出限的計(jì)算方法1）在全球環(huán)境監(jiān)測(cè)系統(tǒng)水監(jiān)測(cè)操作指南 中規(guī)定：給定置信水平為 95% 時(shí)，樣品測(cè)定值與零濃度樣品的測(cè)定值有顯著性差異即為檢出限（ D丄）。這 里的零濃度樣品是不含待測(cè)物質(zhì)的樣品。D丄二 4.6（T式中：（T 空白平行測(cè)定（批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)偏差（重復(fù)測(cè)定 20次以上）。2）國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC對(duì)分析方法的檢出限D(zhuǎn)丄作如下 規(guī)定。在與分析實(shí)際樣品完全相同的條件下，做不加入被測(cè)組分的重復(fù)測(cè)定 （即空白試驗(yàn)），測(cè)定次數(shù)盡可能多（試驗(yàn)次數(shù)至少為 20 次）。算出空白觀 測(cè)值的平均值X.和標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb。在一定置信概率下，被檢出的最小測(cè)量值 X. 以下式確定：X .= Xb+ K&#

4、39; Sb式中： Xb 空白多次測(cè)得信號(hào)的平均值；S b 空白多次測(cè)得信息的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K' 根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)。與XL-Xb（即K Sb）相應(yīng)的濃度或量即為檢出限：D. = X .- Xb/ K = k ' Sb/ K式中： k 方法的靈敏度（即校準(zhǔn)曲線的斜率）。為了評(píng)估X.和S,實(shí)驗(yàn)次數(shù)必須至少20次。1975年，IUPAC建議對(duì)光譜化學(xué)分析法取k' =3。由于低濃度水平的測(cè) 量誤差可能不遵從正態(tài)分布，且空白的測(cè)定次數(shù)有限，因而與 k' =3 相應(yīng)的 置信水平大約為 90%。此外，尚有將 K取為4、4.6、5及6的建議。3）美國(guó)EPASW-84中規(guī)定

5、方法檢出限：MDL=3.1433 （ 5重復(fù)測(cè)定7次）4）在某些分光光度法中，以扣除空白值后的與 0.01 吸光度相對(duì)應(yīng)的濃度值 為檢出限。5）氣相色譜分析的最小檢測(cè)量系指檢測(cè)器恰能產(chǎn)生與噪聲相區(qū)別的響應(yīng)信號(hào) 時(shí)所需進(jìn)入色譜柱的物質(zhì)的最小量，一般認(rèn)為恰能辨別的響應(yīng)信號(hào)，最小應(yīng) 為噪聲的兩倍。最小檢測(cè)濃度系指最小檢測(cè)量與進(jìn)樣量（體積）之比。6）某些離子選擇電極法規(guī)定：當(dāng)校準(zhǔn)曲線的直線部分外延的延長(zhǎng)線與通過(guò)空 白電位且平行于濃度軸的直線相交時(shí)，其交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度值及為該離子選 擇電極法的檢出限。光度分析中， 雖然吸光度最小測(cè)讀值為 0.001 ，靈敏度也以 A=0.001 所相 應(yīng)的被測(cè)物濃度表示

6、， 但實(shí)際上慣常以 A=0.05 相應(yīng)的被測(cè)物濃度作為有充分 置信度的測(cè)定限，即最小能夠可靠測(cè)定的濃度。這是因?yàn)?，在吸光度A接近零的情況下，測(cè)定值與真實(shí)值之比即相對(duì)誤差趨向無(wú)限大。其次，由于比色皿的成對(duì)性不易做到完全匹配，尤其是使用已久的比色 皿的成對(duì)性不易保證，因此吸光度很小的測(cè)量值在不同操作者、不同試驗(yàn)室 之間常會(huì)不一致，除非操作者很有經(jīng)驗(yàn)，十分注意比色皿成對(duì)性對(duì)測(cè)量的影 響，并在每次測(cè)量時(shí)予以試驗(yàn)校正。第二節(jié) 測(cè)定限測(cè)定限為定量范圍的兩端，分為測(cè)定上限與測(cè)定下限。1. 測(cè)定下限在測(cè)定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下，用特定方法能準(zhǔn)確地定量測(cè)定待 測(cè)物質(zhì)的最小濃度或量，稱為該方法的測(cè)定下限。測(cè)定

7、下限反映出分析方法能準(zhǔn)確地定量測(cè)定低濃度水平待測(cè)物質(zhì)的極限 可能性。在沒有（或消除了） 系統(tǒng)誤差的前提下， 他受精密度要求的限制 （精 密度通常以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。分析方法的精密度要求越高，測(cè)定下限高 于檢出限越多。美國(guó)EPASW-84中規(guī)定4MDL為定量下限（RQL，即4倍檢出限濃度作 為測(cè)定下限，其測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為 10%。日本 JIS 規(guī)定定量下限為 10 倍的 MDL。2. 測(cè)定上限在限定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下，用特定方法能夠準(zhǔn)確地定量測(cè)定 待測(cè)物質(zhì)的最大濃度或量，稱為該方法的測(cè)定上限。對(duì)沒有（或消除了）系統(tǒng)誤差的特定分析方法的精密度要求不同，測(cè)定上限 也將不同。測(cè)定限對(duì)

8、于定量分析，進(jìn)一步計(jì)算才能得到與分析物有關(guān)的值（例如，各個(gè)結(jié)果的平均值）。因此，條件更加苛刻，所以測(cè)定限總是高于檢出限。3. 檢測(cè)限有三種常用的表示方式（1）儀器檢測(cè)下限可檢測(cè)儀器的最小訊號(hào)，通常用信噪比來(lái)表示 , 當(dāng)信號(hào)與噪聲之比大 于等于 3 時(shí)，相當(dāng)于信號(hào)強(qiáng)度的試樣濃度，定義為儀器檢測(cè)下限。（2）方法檢測(cè)下限即某方法可檢測(cè)的最低濃度。 通常用低濃度曲線外推法可求的方法檢 測(cè)下限。（3）樣品檢測(cè)下限即相對(duì)于空白可檢測(cè)的樣品最小含量。樣品檢測(cè)下限定義為：其信號(hào) 等于測(cè)量空白溶液的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 3 倍時(shí)的濃度。檢測(cè)下限是選擇分析方法的重要因素。 樣品檢測(cè)下限不僅與方法檢測(cè) 下限有關(guān)，而且與

9、空白樣品中空白含量以及空白波動(dòng)情況有關(guān)。 只有當(dāng)空 白含量為零時(shí)，樣品檢測(cè)下限等于方法檢測(cè)下限 。然而，空白含量往往不 等于零，空白大小受環(huán)境對(duì)樣品的污染，試劑純度、水質(zhì)純度、容器的質(zhì) 地及操作等因素的影響。因此，由外推法可求得方法檢測(cè)下限可能很低， 但由于空白含量的存在，以及空白含量的波動(dòng)，樣品檢測(cè)下限可能要比方 法檢測(cè)下限大得多。從實(shí)用中考慮，樣品檢測(cè)下限較為有用和切合實(shí)際。第三節(jié)最佳測(cè)定范圍1. 最佳測(cè)定范圍（也稱有效測(cè)定范圍）。指在限定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下， 特定方法的測(cè)定下限至測(cè)定 上限之間的濃度范圍。在此范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確地定量測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的濃度或 量。最佳測(cè)定范圍應(yīng)小于方法的適

10、應(yīng)范圍。對(duì)測(cè)量結(jié)果的精密度（通常以 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）要求越高，相應(yīng)的最佳測(cè)定范圍越小。分析方法特性關(guān)系如圖所示。檢出限低濃度最佳測(cè)定范圍高濃度適用范圍分析方法特性關(guān)系圖2. 方法的線性范圍 方法的線性范圍是指信號(hào)與樣品濃度呈線性的工作曲線直線部分。 通 常把相當(dāng)于 10 倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差相應(yīng)的濃度定為方法的線性范圍的定量 檢測(cè)下限。取工作曲線中高濃度時(shí)，彎曲處作為方法的線性范圍的定量檢 測(cè)上限。好的分析方法要有寬的線性范圍。有的分析方法線性范圍只有一 個(gè)數(shù)量級(jí)，有的分析方法線性范圍可達(dá) 56個(gè)數(shù)量級(jí)。同一分析方法可 用常量、微量、痕量的物質(zhì)分析。第四節(jié) 校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線

11、，前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測(cè)量，沒 有經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)程，這對(duì)于樣品往往造成較大誤差；而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶 液經(jīng)過(guò)了與樣品相同的消解、凈化、測(cè)量等全過(guò)程。凡應(yīng)用校準(zhǔn)曲線的分析方法，都是在樣品測(cè)得信號(hào)值后，從校準(zhǔn)曲線上 查得其含量（或濃度）。因此，繪制準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線，直接影響到樣品分析 結(jié)果的準(zhǔn)確與否。此外，校準(zhǔn)曲線也確定了方法的測(cè)定范圍。1. 校準(zhǔn)曲線的繪制用一系列被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的步驟，將被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)?有色溶液。制備好的標(biāo)準(zhǔn)系列和空白，在方法選定的波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。 已被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。1）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列，溶液以純?nèi)軇閰⒈冗M(jìn)行測(cè)量后，應(yīng)先作空白校正，

12、然 后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；2）標(biāo)準(zhǔn)溶液一般可直接測(cè)定，但如試樣的預(yù)處理較復(fù)雜致使污染或損失 不可忽略時(shí)，應(yīng)和試樣同樣處理后再測(cè)定。3）校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號(hào)和貯存時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件的改 變而變動(dòng)。因此，在測(cè)定試樣的同時(shí)，繪制校準(zhǔn)曲線最為理想，否則應(yīng)在測(cè) 定試樣的同時(shí)，平行測(cè)定零濃度和中等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，取均值相減后 與原校準(zhǔn)曲線上的相應(yīng)點(diǎn)核對(duì)，其相對(duì)差值根據(jù)方法精密度不得大于5%10%，否則應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線。2. 校準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)1）線性檢驗(yàn)：即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的精密度。對(duì)于以 46個(gè)濃度單位所獲得 的測(cè)量信號(hào)值繪制的校準(zhǔn)曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)| r | >0.9990，

13、否則應(yīng)找出原因并加以糾正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。2 ）截距檢驗(yàn)：即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度，在線性檢驗(yàn)合格的基礎(chǔ)上，對(duì)其 進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程y= a+bx ，然后將所得截距a與0作t檢驗(yàn)， 當(dāng)取95%!信水平，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異時(shí)，a可做0處理，方程簡(jiǎn)化為y= bx, 移項(xiàng)得 x=y/b 。在線性范圍內(nèi)， 可代替查閱校準(zhǔn)曲線， 直接將樣品測(cè)量信號(hào)值 經(jīng)空白校正后，計(jì)算出試樣濃度。當(dāng) a 與 0 有顯著性差異時(shí)，表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度不高， 應(yīng)找出原因予以校正后，重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗(yàn)合格。在計(jì)算回歸 方程，經(jīng)截距檢驗(yàn)合格后投入使用?；貧w方程如不經(jīng)上述檢驗(yàn)和處理，就直接

14、投入使用，必將給測(cè)定結(jié)果引 入差值相當(dāng)于解決 a 的系統(tǒng)誤差。3) 斜率檢驗(yàn) : 即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度， 方法靈敏度是隨實(shí)驗(yàn)條件的變 化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜 率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如， 一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對(duì)差值小于 5%，而原子吸收分光光 度法則要求其相對(duì)差值小于 10%等等。3. 校準(zhǔn)曲線的控制被測(cè)物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩芤旱姆磻?yīng)稱為顯色反應(yīng)或發(fā)色反應(yīng)。顯色反應(yīng)的介質(zhì)PH條件、顯色劑用量、顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度、為消除共存物干擾而加入 的掩蔽劑、甚至加試劑的順序，都要按照方法步驟的要求執(zhí)行。有時(shí)，標(biāo)

15、準(zhǔn) 系列雖然不像實(shí)際試樣那樣組成復(fù)雜， 但仍要求與試樣進(jìn)行同樣的處理步驟， 以便控制校準(zhǔn)曲線上的數(shù)據(jù)點(diǎn)的空白、回收率等因素。建立校準(zhǔn)曲線時(shí)，測(cè)量吸光度的參比有兩種選擇。第一種方法用純?nèi)軇┳鲄⒈龋?兩個(gè)比色皿都放溶劑時(shí)， “樣品比色皿” 的 吸光度測(cè)定值為比色皿成對(duì)性校正值，此后所有樣品吸光度測(cè)定值都須扣除此值，進(jìn)行校正。然后，以純?nèi)軇閰⒈?，測(cè)定空白及標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度， 繪制校準(zhǔn)曲線。第二種方法直接用空白為參比。當(dāng)兩個(gè)比色皿都放空白時(shí)，測(cè)定比色皿 成對(duì)性校正值，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線。兩種方法得到 的兩條校準(zhǔn)曲線互相平行，但第一種方法可測(cè)定空白的水平，后一種方法不 能測(cè)定空白，

16、理論上校準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)。若空白為零，兩條校準(zhǔn)曲線重合。 無(wú)論用什么作參比，實(shí)樣測(cè)定時(shí)應(yīng)該使用與建立校準(zhǔn)曲線相同的比色皿和同 樣的參比。比色皿的成對(duì)性校正對(duì)于使用已久的比色皿是必要的，尤其是測(cè)量吸光 度很小的樣品時(shí)，校正可保證測(cè)量值的可靠性和重復(fù) 性。第五節(jié)：分析空白一. 分析空白的主要來(lái)源和控制措施 :1. 環(huán)境對(duì)樣品的沾污 .主要是由空氣中的污染氣體和沉降微粒引起的 . 普遍實(shí)驗(yàn)室中每 立方米空氣中含有數(shù)百微克的微粒 . 這些微粒含有多種元素 , 因而可 引起多種和痕量元素的沾污 . 來(lái)自環(huán)境的沾污不但顯著 , 而且變動(dòng)性 大. 應(yīng)采取局部或整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的防塵與空氣凈化措施 .2. 試劑對(duì)樣品

17、的沾污試劑對(duì)樣品的沾污隨試劑用量而變化 . 對(duì)一定的試劑用量是恒定 的. 樣品處理過(guò)程中用量最多的是水和酸。3. 器皿對(duì)樣品沾污貯存、處理樣品所用的一切器皿，如燒杯、瓶子、過(guò)濾器、研缽等，由于 其材質(zhì)不夠純或者未洗滌干凈均可能沾污樣品。在痕量分析中應(yīng)選用高純惰 性材料制成的器皿，并運(yùn)用合適的清洗技術(shù)。 聚四氟乙烯、透明的合成石英 的高壓聚乙烯是比較合適的器皿材料。4. 分析測(cè)試者對(duì)樣品的沾污分析測(cè)試者用手觸摸樣品可引起多種元素的沾污； 分析測(cè)試者的花妝品常 常不知不覺地帶來(lái)許多元素的沾污；分析測(cè)試者使用的內(nèi)服和外用藥物也常 常沾污樣品；以及分析測(cè)試者若不注意個(gè)人衛(wèi)生也會(huì)引起樣品的沾污。所以， 分析測(cè)試者不但要具有正確熟練的操作技巧，而且要知道自身對(duì)樣品可能帶 來(lái)什麼沾污，以采取消除沾污的必要措施。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將分析測(cè)試 者可能引入地沾污概述于表 2-6