細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)習(xí)

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.體外培養(yǎng)的細(xì)胞按生長方式可分為哪二種? 按細(xì)胞在體外生長的形態(tài)特征,可分為哪幾種常見類型?試述上皮型細(xì)胞的起源及主要形態(tài)學(xué)特征；成纖維型細(xì)胞的起源及主要形態(tài)學(xué)特征?！窘獯稹浚喊瓷L方式分為二型： 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 （絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞。）按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為以下類型：(1)上皮型細(xì)胞 (2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞 (4)多形型細(xì)胞上皮型細(xì)胞來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞（個別例外） 如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的

2、上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 生長特點：易相連成片；相靠緊密相連成薄層鋪路石狀；生長時呈膜狀移動， 很少脫離細(xì)胞群而單個活動。成纖維型細(xì)胞：來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核生長特點： 排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨行動； 游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起。2.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個生命活動過程的分期及每代貼附生長細(xì)胞的生長過程【解答】： 通常，體外培養(yǎng)細(xì)胞的全部生命期大致可被分為以下三個階

3、段：原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是指從機(jī)體中取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代之前的這一階段。此期的細(xì)胞呈現(xiàn)出活躍移動的特點，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。處于原代培養(yǎng)階段的細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上有很大的相似性。細(xì)胞群具有明顯的異質(zhì)性，細(xì)胞間的相互依存性強(qiáng)，在軟瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)時細(xì)胞集落形成率很低。傳代期 傳代期通常是培養(yǎng)細(xì)胞全生命期中持續(xù)時間最長的時期，原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)傳代后常被稱做細(xì)胞系（cell line）。一般情況下，正常體細(xì)胞在傳代10-50次左右后，細(xì)胞分裂的能力就會逐漸減弱，甚至完全喪失，細(xì)胞便進(jìn)入衰退期。衰退期處于衰退期的培養(yǎng)細(xì)胞，增殖速率已經(jīng)變得很慢或不再增殖，直至最后

4、衰退死亡。上文所述特點，主要是針對體外培養(yǎng)的機(jī)體正常細(xì)胞，對于體外發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞而言，永生性（immortality）或惡型性（malignancy）的獲得使得這類細(xì)胞獲得持久性的增殖能力，這樣的細(xì)胞群體常被稱為無限細(xì)胞系（infinite cell line），或連續(xù)細(xì)胞系（continuous cell line）。每代貼附生長細(xì)胞的生長過程：游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 時間：10分鐘一4小時貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。 底物：玻璃、塑料、膠原、其它細(xì)胞等潛伏期此時細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6

5、24小時。對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。停止期（平臺期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂n 機(jī)制：接觸抑制、密度限制3.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞對生存環(huán)境的基本要求.【解答】： 細(xì)胞的營養(yǎng)需要：基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸（種谷氨酰胺）維生素葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機(jī)離子等促細(xì)胞生長因子：多由血清提供細(xì)胞的生存環(huán)境：溫度條件對細(xì)胞生長的影響：不同生物來源的組織細(xì)胞培養(yǎng)溫度不同；體外培養(yǎng)動物細(xì)胞最常用的溫度是37。耐低溫不耐高溫！在生理溫度范圍內(nèi)，溫度與細(xì)胞生長率之間存在正相關(guān)關(guān)系。（復(fù)習(xí)：溫度對酶促反應(yīng)的影響） 氣相環(huán)境對細(xì)胞生長的影響：動物細(xì)胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都

6、是采用5%CO2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。2參與細(xì)胞的能量代謝過程。2用于維持培養(yǎng)液的酸堿度。一般多為開放式培養(yǎng) 培養(yǎng)液的酸堿度對細(xì)胞生長的影響：大多數(shù)的有機(jī)體細(xì)胞能在pH6.08.0的環(huán)境中生存。最適宜的pH值范圍是7.27.4。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力無污染、無毒（前提條件?。?什么是細(xì)胞培養(yǎng)用液,主要分為哪幾類?【解答】： 培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶液。主要包括：平衡鹽溶液 ； 培養(yǎng)基； 其他培養(yǎng)用液 。5D-Hanks與Hanks的主要區(qū)別是什么?【解答】： D-Hanks不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶

7、液。6簡述胰酶的常用濃度及配制時的注意事項。【解答】：胰酶(trypsin)溶液： 濃度一般為0.10.25 配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液 。7.細(xì)胞培養(yǎng)中血清的主要作用？【解答】：(1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì) ； (2)提供貼壁和擴(kuò)展因子 (3)提供激素及各種生長因子； (4)提供結(jié)合蛋白 (5)對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用 8.血清的使用與儲存有哪些注意事項？【解答】：(1) 使用前的處理：血清在使用前通常在56加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。儲存條件： 血清一般儲存于

8、20,同時應(yīng)避免反復(fù)凍融 。大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如10ml、20ml、50ml，儲存于-20，使用前融化。融化后的血清在4不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。9.簡述干粉培養(yǎng)基的配制過程?！窘獯稹浚篋MEM培養(yǎng)液的配制（舉例）：900 mL ddH2O于1000 mL燒杯中，將DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。用510的NaHCO3調(diào)pH至7.2加青、鏈霉素至終濃度100u/mL 和100ug/mL 用0.22um的濾膜過濾除菌。分裝（200 mL左右）后4冰箱保存。 10.細(xì)胞培養(yǎng)工作室可分為那幾個部分

9、，各有什么作用?【解答】：一般包括：準(zhǔn)備室、培養(yǎng)室和緩沖室準(zhǔn)備室：用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等。培養(yǎng)室：用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無菌操作的實驗室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。天花板不宜高過2.5M。緩沖室：（更衣室）11. CO2培養(yǎng)箱的作用及使用中的注意事項?！窘獯稹浚河糜诰S持適當(dāng)溫度、濕度與pH質(zhì)量關(guān)鍵在控溫裝置，溫度變化一般不應(yīng)超過0.5度;培養(yǎng)箱的溫度設(shè)在3537，這是人和哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度。 培養(yǎng)容器需與外界保持通氣狀態(tài)箱內(nèi)空氣應(yīng)保持干凈，定期消毒（紫外燈、酒精）水槽:保持一定濕度12. 試述清潔液的配方組

10、成及配制時的注意事項。【解答】：清潔液 :重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）強(qiáng)清潔液 631000200 次強(qiáng)清洗液 120 2001000 弱清潔液 100 1001000配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸，并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色13簡述消毒滅菌的常用方法、要求條件及主要應(yīng)用范圍?！窘獯稹浚何锢硐緶缇ㄗ贤饩€：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿。 消毒時間：30min（至少） 紫外殺菌功能除了紫外本身以外，還可以由

11、產(chǎn)生的臭氧來完成。紫外滅菌以后，最好過一個小時再進(jìn)去。過濾：0.22m（適用于液體）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）15磅,121，20min各種物品有效消毒壓力和時間不同，一般要求如下： 培養(yǎng)用液、橡膠制品 l0磅l0分鐘 布類、玻璃制品、金屬器械等 15磅20分鐘干烤：160, 2 小時（適用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打開箱門，以防止冷空氣驟然進(jìn)入引起玻璃炸裂，影響消毒效果。化學(xué)消毒滅菌法7%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。1新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?？股刂饕糜谂囵B(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。在細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素是青霉素（常用濃

12、度是100u/ml）與鏈霉素（100g/ml）。建議不要在原代培養(yǎng)中加入抗生素 。14. 如何對玻璃器皿進(jìn)行有效清洗？【解答】：玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗(+烘干)浸酸沖洗清洗后的玻璃器皿：干凈透明無油跡。浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等。先用自來水簡單刷洗，然后用5稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的殘留蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。刷

13、洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。自然晾干或烘干后泡酸。浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液（洗液）中。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6 小時。沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗,使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。最好用洗滌裝置。如用手工操作，需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，然后用蒸餾水清洗3-5 次，晾干（或烘干）備用15細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素及使用濃度是什么?【解答】：青霉素（常用濃度是1

14、00u/ml）與鏈霉素（100g/ml）。16什么是原代培養(yǎng)？簡述原代培養(yǎng)方法的分類及主要操作步驟。【解答】：原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)方法分類：貼塊法和消化法。消化法又分為冷消化與熱消化；一次性消化與分次消化。主要步驟：貼塊法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織切成約1mm3大小的植塊，用于植塊培養(yǎng)。消化法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織剪碎蛋白酶溶液消化機(jī)械方吹打組織塊對濾過液離心（<1000r/min, <10min）用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度用于分離細(xì)胞培養(yǎng)17何謂傳代培養(yǎng)？簡述貼壁細(xì)胞的傳代操作步驟?！窘獯?/p>

15、】：傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)：選取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的D- Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片(思考：還有什么作用？）加入適量0. 0.25胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。以1：2或1：3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長情

16、況。18收集細(xì)胞時一般常用的轉(zhuǎn)速和時間是多少？【解答】：1000r/min；5min19. 什么是冷凍保存？影響細(xì)胞冷凍保存效果的因素有哪些？【解答】：冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的過程。冷凍速率當(dāng)冷凍速度過慢時，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時即失去活性。冷凍速度過慢，還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，

17、產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。 冷凍保存溫度：液氮溫度(-196)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70-80條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降。 復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。一般來說復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37水浴中，于12min內(nèi)完成復(fù)溫。 在冷凍復(fù)蘇中遵循：慢凍速溶原則！冷凍保護(hù)劑：是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。分為：滲透性： 常用甘油、DMSO 非滲透性甘油或二甲基亞砜這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性，且對細(xì)胞無明顯毒性。 保護(hù)機(jī)制：是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透

18、到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時，細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。20簡述培養(yǎng)細(xì)胞的非玻璃化凍存過程?！窘獯稹浚悍遣ＡЩ瘍龃媸抢酶鞣N溫級的冰箱分階段降溫至-70-80，然后投入液氮進(jìn)行保存；該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。 凍存過

19、程： (1)待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物,制備成單細(xì)胞懸液,計算細(xì)胞總數(shù)。將細(xì)胞懸液以8001000rmin離心5min，棄上清液。向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×1061×107個/ml。按每管11.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存日期。(2)分級冷凍：先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(48)，約40min。接著置于普通冰箱冷凍層(-10-20)，3060min。再于-30放置30min左右（可省略）。然后在-70-80下過夜。最后將凍存小管投入液氮保存。還有一種簡單的方法，

20、就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4預(yù)冷的冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，立刻將小盒放置在-70-80冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。(3)記錄：做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經(jīng)手人。21凍存的細(xì)胞一般如何復(fù)蘇？【解答】：復(fù)蘇過程：1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至3740。2)從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成復(fù)溫。3)將細(xì)胞凍存懸

21、液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。 4)將細(xì)胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。5)給細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。22DMSO使用時應(yīng)注意哪些事項？【解答】：在使用DMSO前，不需要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身有滅菌作用。 在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制冷凍保護(hù)劑時最好帶手套。由于許多冷凍保護(hù)劑(如DMSO)在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時洗除冷凍保護(hù)劑。23運送細(xì)胞的比較簡便的方法是哪一種，簡述其過程?！窘獯稹浚阂皇怯靡旱蚋杀４孢\輸，效果較好，但需用特制容

22、器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適于空運，比較麻煩;二是充液法運輸，比較簡便。充液法運輸操作如下： 選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80%或90%匯合時，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要達(dá)到培養(yǎng)瓶的頸部(過滿易污染)，保留少許空間，塞緊瓶塞，空氣過多運輸中氣泡運動易使細(xì)胞脫落;妥善包裝和運送；一般在不超過四五天到達(dá)目的地的情況下，對細(xì)胞活力無嚴(yán)重影響;到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留正常量，置37培養(yǎng)，次日傳代。24. 簡述細(xì)胞污染的概念及種類.【解答】：細(xì)胞污染: 凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，都應(yīng)視為污染。組織培養(yǎng)污染應(yīng)包括:微生物：真菌、細(xì)菌、支原體和病毒(最

23、常見）化學(xué)物質(zhì)：影響細(xì)胞生存的非細(xì)胞所需的化學(xué)成分細(xì) 胞：非同種的其它細(xì)胞（不同細(xì)胞類型的交叉污染）25. 細(xì)胞培養(yǎng)中常見有哪些微生物污染，有何主要特征？【解答】：微生物污染及其表現(xiàn)：真菌污染：真菌種類繁多，形態(tài)各異，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。細(xì)菌污染：細(xì)菌污染后大多能改變培養(yǎng)液pH使培養(yǎng)液變混濁，毒性大的細(xì)菌很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個別少量細(xì)菌的污染。支原體污染：支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、

24、不易被察覺和干擾實驗結(jié)果的一種污染。 26. 細(xì)胞培養(yǎng)中污染主要通過哪些途徑，一般如何預(yù)防？【解答】：污染途徑：空氣: 培養(yǎng)設(shè)施不宜置于通風(fēng)場所；定期清理凈化工作臺的過濾層，防止阻塞；操作中應(yīng)減少空氣流動；帶口罩；夏季潮濕季節(jié)空氣中含菌數(shù)量多，每立方米內(nèi)含菌數(shù)不應(yīng)超過15個。清洗消毒培養(yǎng)器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養(yǎng)用液滅菌不徹底等，都可引入有害物。操作實驗操作馬虎、動作不準(zhǔn)確、消毒觀念不強(qiáng)，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時不嚴(yán)，都可發(fā)生污染。同時培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞，操作不慎，使用同一吸管或培養(yǎng)用液，可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。 血清血清也是污染細(xì)胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴(yán)

25、，常已被支原體和病毒污染。組織初代培養(yǎng)組織常有污染；有的是在手術(shù)中污染，有的本身可能是被污染的組織(如已經(jīng)發(fā)生潰爛的腫瘤組織)；手術(shù)用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染 。27 細(xì)胞計數(shù)的操作要領(lǐng)及計算公式是什么？【解答】：具體操作程序如下：取血細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片，用75%酒精擦凈。將蓋玻片放于計數(shù)板上。用滴管取混合均勻的細(xì)胞懸液，滴入計數(shù)室內(nèi)。要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。滴加細(xì)胞懸液后約靜置1分鐘后則可以進(jìn)行計數(shù)。統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，分別數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細(xì)胞數(shù)。對壓

26、邊線細(xì)胞：計上不計下，計左不計右 計算：一般以每毫升含細(xì)胞數(shù)來表示 大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才為1ml體積。所以計算公式為：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml（ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×104 ×稀釋倍數(shù)計數(shù)中，如果細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細(xì)胞數(shù)太少,可離心濃縮后再計。每個細(xì)胞懸液至少滴樣兩次求平均值。 用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)時應(yīng)注意的事項:不要漏計，不要重復(fù)細(xì)胞懸液應(yīng)混合均勻濃度不可過高也不可過低。28. 簡述細(xì)胞生長曲線繪制過程及其應(yīng)用?！窘獯稹浚杭?xì)胞生長曲

27、線(cell growth curve)是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，可根據(jù)細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞增殖速度，確定細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。 制作方法：培養(yǎng)細(xì)胞 首先在2孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞。計數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。接種時間記為0 h。計數(shù)細(xì)胞密度 從接種時間算起，每隔24h計數(shù)孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。為提高準(zhǔn)確率，對每孔細(xì)胞可計數(shù)23次。如此操作至第七天結(jié)束。繪制曲線 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線。29. 簡述MTT比色法的原理及操作過

28、程?！窘獯稹浚涸恚夯罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙Y(jié)晶，后者被DMSO（或酸性異丙醇）溶解后所呈現(xiàn)的色度(用OD值表示)反映出活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無此酶活性。1.MTT溶液的配制用PBS液(pH7.2)或者生理鹽水將MTT配成5mgm1的溶液。（用0.2µm濾膜過濾）。保存：于4避光保存。可用2周。若暫不用，可凍存。 2.實驗過程將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板。按不同實驗要求處理細(xì)胞。每孔加入15-20µlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)34h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入200µlDMSO,在微型振蕩器振蕩5min,充分溶

29、解混勻。在酶標(biāo)儀上測定光吸收。測定波長為490nm，以只加培養(yǎng)液的的培養(yǎng)皿為空白對照。3.結(jié)果分析 細(xì)胞存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值*1004.注意事項(1)高濃度血清可影響光吸收值,常使用含10%血清的培養(yǎng)液,在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養(yǎng)液。(2)吸去培養(yǎng)液時動作要慢,以免吸去形成的結(jié)晶。30. 簡述臺盼藍(lán)排除檢測法原理【解答】：原理：由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。而活細(xì)胞反之，能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細(xì)胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細(xì)胞。最常用的為“臺盼藍(lán)排除檢測法”(2)活體染色與細(xì)胞計數(shù)