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1、無菌檢查操作規(guī)程1、 目的建立無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,規(guī)范無菌檢查操作過程,確保檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。2、 范圍本規(guī)程適用于廣州賽哲生物科技股份有限公司無菌檢查操作過程。3、 職責(zé)相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的具體實(shí)施,質(zhì)檢部負(fù)責(zé)對(duì)本規(guī)程的實(shí)施過程進(jìn)行監(jiān)督。4、 工作程序4.1培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可按以下給出的處方制備,也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或成品培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光環(huán)境下,三周內(nèi)使用。4.1.1硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng),也可用于需氧菌的培養(yǎng)。配方如下:名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨15.0 g氯化鈉2.5g酵母浸

2、出粉5.0 g新配制得0.1刃天青溶液1.0ml無水葡萄糖5.0 g瓊脂0.75gL-胱氨酸0.5 g水1000ml硫乙醇酸鈉0.5 g除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)p H 為弱堿性,煮沸,濾清,加入葡萄糖和刃天青溶液,搖勻,調(diào)節(jié)pH,使滅菌后在25的pH值為7.1土0.2。分裝至適宜的容器中,其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層(粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5,否則,須經(jīng)100°C水浴加熱至粉紅色消失(不釋過20分鐘),迅速冷卻,只限加熱一次,并防止被污染。除另有規(guī)定外,硫乙

3、醇酸鹽流體培養(yǎng)基置3035培養(yǎng)。4.1.2胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。配方如下:名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨17.0g氯化鈉5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml除葡萄糖外,取上述成分,混合,微溫溶解,濾過,調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25的pH值為7.3±0.2,加入葡萄糖,分裝,滅菌。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置2025培養(yǎng)。4.1.3胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制方法如下:名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨15.0g瓊脂15.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g水1000ml氯化鈉5.0g除瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH使滅菌

4、后在25的pH值為7.3±0.2,加人瓊脂,加熱溶化后,搖勻,分裝,滅菌。4.1.4沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于黑曲霉的培養(yǎng)。培養(yǎng)如下:名稱數(shù)量動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g葡萄糖40.0g瓊脂15.0g水1000ml除葡萄糖、瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25的pH值為5.6士0.2,加入瓊脂,加熱溶化后,再加入葡萄糖,搖勻,分裝,滅菌。4.2培養(yǎng)基的無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶),置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天,應(yīng)無菌生長。4.3培養(yǎng)基的靈敏度檢查4.3.1菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得

5、的干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) CMCC(B)10 104枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98 001黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 0034.3.2菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)

6、基上,接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)1824小時(shí);接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,2025培養(yǎng)2448小時(shí),上述培養(yǎng)物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上,2025培養(yǎng)57天,加入35ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌氯化

7、鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置,應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用;若保存在28°C可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28°C,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。4.3.2培養(yǎng)基的接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)3天;取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接種作為空白對(duì)照,培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。4.3.3 結(jié)果判定

8、空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長,若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好,判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。4.4方法適應(yīng)性試驗(yàn)4.4.1菌種及菌液制備除大腸埃希菌(Escherichia coli) (CMCC(B)44 102外,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。4.4.2膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌,過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器,加入等量試驗(yàn)菌,作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng),培養(yǎng)

9、時(shí)間不得超過5天,各試驗(yàn)菌同法操作。4.4.3直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙酵酸鹽流體培養(yǎng)基6管,分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管,取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管,分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量,另1管作為對(duì)照,置規(guī)定的溫度培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。4.4.4結(jié)果判斷與對(duì)照管比較,如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好,則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì),照此檢査方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試

10、品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長,則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用,應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法,消除供試品的抑菌作用,并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。4.5供試品的無菌檢查無菌檢査法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許,應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無菌試驗(yàn)過程中,若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑,應(yīng)證明其有效性,且對(duì)微生物無毒性。4.5.1陽性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對(duì)照菌:無抑菌作用及抗革蘭陽性

11、菌為主的供試品,以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌;抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌;抗厭氧菌的供試品,以生孢梭菌為對(duì)照菌;抗真菌的供試品,以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法適用性試驗(yàn),加菌量小于100cfu,供試品用量同供試品無菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對(duì)照管培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)應(yīng)生長良好。4.5.2陰性對(duì)照供試品無菌檢查時(shí),應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作,作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長。供試品處理及接種培養(yǎng)基操作時(shí),用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒,如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度,可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭)向容器內(nèi)導(dǎo)人無菌空氣,再

12、按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。4.5.3薄膜過濾法薄膜過濾法一般應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢査用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m,直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí),應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾,以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml,且總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。4.5.3.1水溶性供試品的制備取規(guī)定量,直接過濾,或混合至含不少

13、于100ml適宜稀釋液的無菌容器中,混勻,立即過濾。如供試品具有抑菌作用,須用沖洗液沖洗濾膜,沖洗次數(shù)一般不少于三次,所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗(yàn)。除生物制品外,一般樣品沖洗后,1份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,1份濾器中加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。生物制品樣品沖洗后,2 份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,1份濾器中加人100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。4.5.3.2水溶性固體供試品的制備取規(guī)定量,加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶,然后照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。4.5.4直接接種法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢査的供試品,即取規(guī)定量供試品

14、分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外,一般樣品無菌檢查時(shí)兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相等;生物制品無菌檢査時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)為2:1。除另有規(guī)定外,每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%,同時(shí),硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml,胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢査時(shí),培養(yǎng)基的用量和髙度同方法適用性試驗(yàn)。4.5.4.1固體供試品的制備取規(guī)定量,直接等量接種至各管培養(yǎng)基中?;蚣尤脒m宜的溶劑溶解,或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后,取規(guī)定童等量接種至各管培養(yǎng)基中。4.5.5培養(yǎng)及觀察將

15、上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天;接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份,一份置3035培養(yǎng),一份置2025培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,培養(yǎng)14天后,不能從外觀上判斷有無微生物生長,可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3天,觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁;或取培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。4.5.6結(jié)果判斷陽性對(duì)照管應(yīng)生長良好,陰性對(duì)照管不得有菌生長。否則,試驗(yàn)無效。若供試品管均澄清,或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長,判供試品不符合規(guī)定,除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效,即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少

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