正交法測幾種因素對酶活力的影響

1、正交法測幾種因素對酶活力的影響一、實驗原理1、酶反應(yīng)受到多種因素的影響，如底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑和抑制劑等都能影響酶反應(yīng)速度，并且各因素之間也相互影響（交互作用）。1）底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對酶反應(yīng)速度的影響3）溫度對酶反應(yīng)速度的影響最適溫度不是一個固定的常數(shù)，它受底物的種類、濃度；溶液的離子強度、pH、反應(yīng)時間等的影響。4）pH對酶反應(yīng)速度的影響最適pH和最適溫度一樣，也不是一個固定的常數(shù)，2、正交法1）正交法是利用正交表來安排多因素試驗、尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗設(shè)計方法。它從多因素試驗的全部水平組合中挑選部分有代表性的水平組合進行試驗，通過對這部分試驗

2、結(jié)果的分析了解全面試驗的情況，找出最優(yōu)水平組合。2）正交法的優(yōu)點：用較少的試驗獲得較全面的數(shù)據(jù)結(jié)果，避免了在多因素、多水平試驗中對每個因素的每個水平都互相搭配進行的全面試驗，節(jié)省大量的人力、物力，縮短了實驗時間。3）正交表的正交性：表中每一列（因素）各水平的重復(fù)數(shù)相等；表中任意兩列橫向形成的有序數(shù)對中，所有各種可能的有序數(shù)對的重復(fù)數(shù)相同。用正交表安排的實驗，具有均衡分散的特點。即按正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布式均衡的。4）正交實驗的一般流程列出試驗中的因素和水平數(shù)選擇合適的正交表根據(jù)正交表進行實驗設(shè)計實驗并收集數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)論5）結(jié)果分析利用各因素同一水平試驗指標(biāo)

3、之和及平均數(shù)，可比較因素不同水平對試驗的影響程度。計算極差，可比較不同因素的影響程度。找出最佳試驗條件（理論值）。3、本實驗選取四個因素，即底物濃度S、酶濃度E、溫度、 pH 值，每個因素選三個水平，選擇L9正交表設(shè)計實驗，實驗設(shè)計如下表：表 1因素水平1S/ml2E/ml3溫度/4pH10.20.237720.50.550830.80.86094、本實驗測定的是胰蛋白酶的活力，以血紅蛋白為底物，血紅蛋白水解后的產(chǎn)物多肽或氨基酸可用Folin-酚顯色，在680nm下比色來得到產(chǎn)物濃度，從而通過一定時間內(nèi)生成產(chǎn)物的量來判斷酶反應(yīng)的速度。二、實驗試劑1、2%血紅蛋白液2、15%三氯乙酸（TCA）溶

4、液3、0.3mg/mL牛胰蛋白酶（1：250）4、0.04mol/LpH為7、8、9的巴比妥鈉-HCl緩沖液5、Folin-酚試劑：Folin-A():Na2CO3-NaOHFolin-A(): CuSO4-酒石酸鉀（鈉）臨用前將A()和A()按50：1體積比混合得Folin-A試劑。Folin-B試劑：約1mol/L。三、實驗器材溫度計、試管*30、漏斗*10、移液槍、5mL移液管、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計四、實驗操作按下表進行操作：表 2實驗號試劑/mL1682493572%血紅蛋白液0.20.50.80.20.50.80.20.50.8緩沖溶液pH72.6pH81.7pH91.7pH8

5、2.3pH92.3pH71.4pH92.0pH72.0pH82.037預(yù)溫5min50預(yù)溫5min60預(yù)溫5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237反應(yīng)10min50反應(yīng)10min50反應(yīng)10min反應(yīng)10min后，各管均加入15%三氯乙酸溶液2mL終止反應(yīng)。另取試管一支做非酶對照，即加2%血紅蛋白液0.5mL，緩沖液2.0mL，先加15%TCA2mL，搖勻放置10min后再加入酶液0.5mL。將上述酶促和非酶對照各管反應(yīng)液，室溫放置15min，過濾，濾液留待Folin-酚法測定酶活力。Folin-酚法測定酶活力：取濾液0.5mL，加入試劑A 4 mL，室溫放置10

6、min，再加試劑B0.5 mL，室溫靜置30min后，于680nm處測吸光度。五、注意事項1、應(yīng)確保酶促反應(yīng)的溫度及反應(yīng)時間的準(zhǔn)確性。2、為減少顯色反應(yīng)時間帶來的誤差，F(xiàn)olin試劑的加入順序和最后測定吸光度的順序應(yīng)保持一致，且間隔時間應(yīng)盡量相同。3、加入Folin-B試劑后應(yīng)迅速搖勻，加一管搖一管，使還原反應(yīng)產(chǎn)生于磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。六、實驗結(jié)果表 31S/ml2E/ml3溫度/4pH試驗結(jié)果A650nm11 0.21 0.21 371 70.22421 0.22 0.52 502 80.19431 0.23 0.83 603 90.09642 0.51 0.22 503 90.0

7、3552 0.52 0.53 601 70.14362 0.53 0.81 372 80.58273 0.81 0.23 602 80.06883 0.82 0.51 373 90.30793 0.83 0.82 501 70.4030.5140.3271.1130.7700.7600.6440.6320.8440.7781.0810.3070.408/30.1710.1090.3710.257/30.2530.2150.2110.281/30.2590.3600.1020.136極差0.0880.2510.2690.121以吸光度值（/3，/3，/3）為縱坐標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫坐標(biāo)作圖:由以

8、上實驗結(jié)果分析得出結(jié)論：1） 對于因素1（底物濃度），水平三（血紅蛋白0.8mL，濃度0.267mol/L）為所比較三水平中的最適條件。2） 對于因素2（酶濃度），水平三（胰蛋白酶0.8mL，濃度0.267mol/L）為所比較三水平中的最適條件。3） 對于因素3（溫度），水平一（37）為所比較三水平中的最適條件。4） 對于因素4（pH），水平2（pH=8）為所比較三水平中的最適條件。5） 比較極差發(fā)現(xiàn)，因素3（溫度）各水平的極差最大，因素1（底物濃度）各水平的極差最小，說明在本次實驗考慮的各參數(shù)范圍內(nèi)，溫度對胰蛋白酶活力的影響最大，底物濃度對胰蛋白酶活力的影響最小。七、分析與討論1、經(jīng)查閱資料

9、得，胰蛋白酶的最適溫度為37，最適pH為7.88.5，實驗結(jié)果符合文獻值。同時，對因素1和因素2的實驗結(jié)果，也符合底物濃度和酶濃度對酶反應(yīng)速率影響的理論。2、本次實驗過程中，由于操作失誤，在測定1號和6號實驗管的吸光度時沒有將波長調(diào)至650nm，而重做1、6號產(chǎn)物的顯色。但最終發(fā)現(xiàn)，第二批顯色的結(jié)果與第一批結(jié)果明顯不屬于同一個系列。討論后猜測原因是，第一次與第二次做顯色時的條件并不完全相同，由于試管太多，第一次加Folin-A、Folin-B試劑的間隔可能沒有掌握好，而第二次單獨做1、6時的時間控制得較好，而此時用第一次制備的0號管作為基準(zhǔn)顯然是不合適的。我認(rèn)為，在單獨重做1、6號管的顯色時應(yīng)當(dāng)重新做一個0號管作為相同條件下的比色基準(zhǔn)