酶聯(lián)免疫吸附實驗

1、ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗在動物生產(chǎn)過程中的應(yīng)用簡介隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA試驗，大大提高了ELISA的特異性，由于電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，ELISA更為簡便實用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之一。被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法?；驹鞥LISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響

2、酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。特性用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。如今應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧

3、化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。辣根過氧化物酶過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2

4、.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應(yīng)時的供氫體有幾種：鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA中最常用的一種；聯(lián)大茴香胺（OD），產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；5氨基水楊酸(5AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。堿性磷酸酶系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯

5、磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，371分鐘水解1g磷酸苯二鈉為一個單位。標(biāo)記方法良好的酶結(jié)合物取決于兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因為特異性免疫反應(yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。其標(biāo)記程序

6、為：將5g HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4冰箱2小時，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析過夜（4），次日離心除

7、去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測定后，冷凍干燥或低溫保存。效果測定測定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。 酶與抗體的活性常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使

8、用濃度。 結(jié)合物的定量測定一般是對結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進(jìn)行測定，然后按下列公式計算：酶量（mg/ml）=OD403×0.42IgG量（mg/ml）=（OD280OD403×0.4）×0.94×0.62對于過碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計算：IgG量（mg/ml）=（OD280OD403×0.34）×0.62已知酶量和IgG量后，即可計算出標(biāo)記抗體的摩爾（mol）比值。HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4結(jié)合物中酶總量=HRP

9、（mg/ml）×結(jié)合物溶液量結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時加入的酶量×100%用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達(dá) 1000(g/ml時效果最好。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時最好。酶結(jié)合率為 7%時效果一般，為9%10%較好，達(dá)30%以上時最好。ELISA方法的基本類型、用途及操作程序根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量

10、板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）；再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（CELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。間接ELISA本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下。 材料 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液； DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清； ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

11、 方法步驟 加抗原包被 4過夜，洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體 37 2小時，洗滌三次、拋干 加底物液 37 30分鐘，加終止液 用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。 結(jié)果判定已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）2.1，而且已知陽性血清的OD值0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）2.1，而且待檢血清的OD值0.4，則判為陽性，否則判為陰性。雙抗體夾心本法主要用于檢測大分子抗原?，F(xiàn)以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。 加抗體包被 4過夜，洗滌三次、拋干

12、加待檢抗原 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 15分鐘，加終止液 用ELISA檢測儀測定OD值。雙夾心ELISA此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為： 加抗體（Ab-1）包被 4過夜，洗滌三次、拋干 加待檢抗原（Ag） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加用非同種動物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2) 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘，加終止液 用

13、ELISA檢測儀測定OD值。競爭ELISA此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測定。其基本程序為： 抗體包被 4過夜，洗滌三次、拋干 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對照孔僅加酶標(biāo)抗原） 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測儀測定OD值。被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因為抗原的結(jié)構(gòu)不

14、同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。阻斷ELISA本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬?。≒R）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序： 100l AP2型工作量抗原包被 4過夜，洗滌三次、拋干 用200l阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100l 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加100l工作量兔抗AP2型血清 37 30分鐘，洗滌三次、拋干 加100l工作量豬抗兔IgG-HRP 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加100l

15、OPD底物液 37 20分鐘，加終止液 用ELISA檢測儀測定OD值。本試驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照?？贵w捕捉ELISA本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷?？贵w捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序為： 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被37 60分鐘后置4過夜，洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗原 37 60分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分

16、鐘，加終止液 用ELISA檢測儀測定OD值。斑點ELISA與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節(jié)省抗原等優(yōu)點，而且結(jié)果可長期保存；但其也有不足，主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：載體膜的預(yù)處理及抗原包被取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加4053個樣品，每個壓圈可加抗原液120l。 封閉將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37感作1530分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。 加被檢

17、血清可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37反應(yīng)一定時間，用洗滌液洗三次，每次13分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。 加酶標(biāo)抗體，37反應(yīng)一定時間后，用洗滌液洗三次。顯色加入新鮮配制的底物液，37反應(yīng)一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。 結(jié)果判定以陽性、陰險血清作為對照，膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點者為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。布ELISA（CELISA）CELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學(xué)者Blais,B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Poly

18、ester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應(yīng)提供較大的表面積，提高反應(yīng)的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，CELISA的主要程序為： 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經(jīng)洗滌及封閉； 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次； 加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次； 加入底物液顯色； 測定OD值。影響因素/酶聯(lián)免疫吸附試驗 編輯酶聯(lián)免疫(ELISA)是如今檢驗科常用的免疫學(xué)檢測方法之一，其操作簡單，無須特殊設(shè)備，使其在各

19、級醫(yī)院都有應(yīng)用。但是，如果忽視了影響其結(jié)果的因素，難免會造成假陰性或假陽性，因此，了解影響實驗的因素，減少差錯事故的發(fā)生是極其必要的。素質(zhì)因素實驗室人員的素質(zhì)主要包括五個方面：思想素質(zhì)、文化素質(zhì)、技術(shù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體素質(zhì)。首先應(yīng)具備一個良好的思想素質(zhì)，因為我們的服務(wù)對象是人，我們的道德水平直接關(guān)系到人們的健康和生命安危，如果馬馬虎虎。三心二意，難免會有差錯事故發(fā)生，我們應(yīng)該熱愛專業(yè)，耐心細(xì)致。在工作中如標(biāo)本混淆、張冠李戴、報告單發(fā)錯等都有可能造成嚴(yán)重后果；其次文化素質(zhì)和技術(shù)素質(zhì)，我們要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術(shù)，認(rèn)真學(xué)習(xí)新理論新知識，努力提高自己的業(yè)務(wù)水平，創(chuàng)造一個能夠勝任本職工作的技術(shù)平臺。良好的心理素質(zhì)就是要勇于面對工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有條不紊，冷靜沉著的處理有關(guān)事務(wù)。人員素質(zhì)問題是影響檢驗結(jié)果的首要因素。標(biāo)本處理因素實驗室人員收到標(biāo)本后應(yīng)認(rèn)真查對，對不符合要求的標(biāo)本和申請單要拘收，合格標(biāo)本要及時分離血清，避免溶血，提取血清時不應(yīng)混有大量纖維蛋白或細(xì)胞成分。對不能及時檢測的標(biāo)本要妥善