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文檔簡(jiǎn)介

1、ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用簡(jiǎn)介隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新,尤其是采用基因工程方法制備包被抗原,采用針對(duì)某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn),大大提高了ELISA的特異性,由于電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用,ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化,從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動(dòng)物檢疫方面,ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法?;驹鞥LISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合,此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性,也不影響

2、酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型,出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此,可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng),顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定,這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái),使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。特性用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室溫下穩(wěn)定;反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn);能商品化生產(chǎn)。如今應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、葡萄糖氧

3、化酶等,其中以HRP應(yīng)用最廣。辣根過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶(HRP)廣泛分布于植物中,辣根中含量最高,從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶(HRP),是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白(含糖量18%),分子量約40 000,約由300個(gè)氨基酸組成,等電點(diǎn)為pH 3-9,催化反應(yīng)的最適pH值因供氫體不同而稍有差異,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。酶的純度以RZ表示:RZ=OD403/OD275純酶的RZ多在3.0以上,最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶,非酶蛋白約占 75%,不能用于標(biāo)記。RZ在2

4、.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫,催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種:鄰苯二胺(OPD),產(chǎn)物為橙色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼觀察判別,容易被濃硫酸終止反應(yīng),顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA中最常用的一種;聯(lián)大茴香胺(OD),產(chǎn)物為橘黃色,最大吸收值在400nm,顏色較穩(wěn)定;5氨基水楊酸(5AS):產(chǎn)物為深棕色,最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性較差;鄰聯(lián)甲苯胺(OT)產(chǎn)物為藍(lán)色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不穩(wěn)定,不耐酸,但反應(yīng)快,顏色明顯。堿性磷酸酶系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取,由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多,常用者為硝基苯

5、磷酸鹽,廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色,可溶,最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中,371分鐘水解1g磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。標(biāo)記方法良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件:即高效價(jià)的抗體和高活性的酶??贵w的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要,因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。酶與抗體交聯(lián),常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行,標(biāo)記效果好,特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序

6、為:將5g HRP溶于0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml,混勻并裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)(或過(guò)夜)使之結(jié)合,然后吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液(5(g/ml)0.2ml,置4冰箱2小時(shí),將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4冰箱30分鐘后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,并對(duì)之透析過(guò)夜(4),次日離心除

7、去不溶物,即得到酶標(biāo)抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進(jìn)行測(cè)定后,冷凍干燥或低溫保存。效果測(cè)定測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。 酶與抗體的活性常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線,經(jīng)PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時(shí),將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng),再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結(jié)合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后,瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA方法進(jìn)行方陣滴定,此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果,還可以確定酶標(biāo)抗體的使

8、用濃度。 結(jié)合物的定量測(cè)定一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定,然后按下列公式計(jì)算:酶量(mg/ml)=OD403×0.42IgG量(mg/ml)=(OD280OD403×0.4)×0.94×0.62對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量,按下列公式計(jì)算:IgG量(mg/ml)=(OD280OD403×0.34)×0.62已知酶量和IgG量后,即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾(mol)比值。HRP/IgG摩爾比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4結(jié)合物中酶總量=HRP

9、(mg/ml)×結(jié)合物溶液量結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般,為500(g/ml時(shí)效果較好,達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果最好。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般,1.0時(shí)效果較好,1.5-2.0時(shí)最好。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般,為9%10%較好,達(dá)30%以上時(shí)最好。ELISA方法的基本類型、用途及操作程序根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型:一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA,即我們通常所指的ELISA(微量

10、板ELISA);另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA);再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA,稱為布ELISA(CELISA)。在微量板ELISA中,又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。間接ELISA本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下。 材料 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液; DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清;待檢鴨血清; ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

11、 方法步驟 加抗原包被 4過(guò)夜,洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時(shí),洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體 37 2小時(shí),洗滌三次、拋干 加底物液 37 30分鐘,加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值,并計(jì)算出P/N比值。 結(jié)果判定已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值(P/N)2.1,而且已知陽(yáng)性血清的OD值0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)2.1,而且待檢血清的OD值0.4,則判為陽(yáng)性,否則判為陰性。雙抗體夾心本法主要用于檢測(cè)大分子抗原?,F(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。 加抗體包被 4過(guò)夜,洗滌三次、拋干

12、加待檢抗原 37 30分鐘,洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體 37 30分鐘,洗滌三次、拋干 加底物液 37 15分鐘,加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。雙夾心ELISA此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于:它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標(biāo)記每一種抗體,還可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)椋?加抗體(Ab-1)包被 4過(guò)夜,洗滌三次、拋干 加待檢抗原(Ag) 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體(Ab-2) 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體(AB-3) 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘,加終止液 用

13、ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。競(jìng)爭(zhēng)ELISA此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原,其原理類似于放射免疫測(cè)定。其基本程序?yàn)椋?抗體包被 4過(guò)夜,洗滌三次、拋干 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原(對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原) 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分鐘,加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少,有色產(chǎn)物就減少,這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè);其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記,而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不

14、同,還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外,試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。阻斷ELISA本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬病(PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測(cè)方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序: 100l AP2型工作量抗原包被 4過(guò)夜,洗滌三次、拋干 用200l阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100l 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加100l工作量兔抗AP2型血清 37 30分鐘,洗滌三次、拋干 加100l工作量豬抗兔IgG-HRP 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加100l

15、OPD底物液 37 20分鐘,加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。抗體捕捉ELISA本法主要用于檢測(cè)IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期,所以檢測(cè)出IgM,則可作為某種疾病的早期診斷??贵w捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA等幾種,其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性,該方法的主要程序?yàn)椋?用抗u鏈(抗IgM重鏈)抗體包被37 60分鐘后置4過(guò)夜,洗滌三次、拋干 加待檢血清 37 2小時(shí),洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗原 37 60分鐘,洗滌三次、拋干 加底物液 37 20分

16、鐘,加終止液 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。斑點(diǎn)ELISA與常規(guī)的微量板ELISA比較,Dot-ELISA具有簡(jiǎn)便、節(jié)省抗原等優(yōu)點(diǎn),而且結(jié)果可長(zhǎng)期保存;但其也有不足,主要是在結(jié)果判定上比較主觀,特異性不夠高等。該方法的主要操作程序?yàn)椋狠d體膜的預(yù)處理及抗原包被取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后,稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽(yáng)性抗原及被檢測(cè)抗原適度稀釋后加入圈中,置37使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點(diǎn)加4053個(gè)樣品,每個(gè)壓圈可加抗原液120l。 封閉將硝酸纖維素膜置于封閉液中,37感作1530分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。 加被檢

17、血清可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置于微量板孔中,再加入一定量適度稀釋的待檢血清,37反應(yīng)一定時(shí)間,用洗滌液洗三次,每次13分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。 加酶標(biāo)抗體,37反應(yīng)一定時(shí)間后,用洗滌液洗三次。顯色加入新鮮配制的底物液,37反應(yīng)一定時(shí)間后,去掉底物液,加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。 結(jié)果判定以陽(yáng)性、陰險(xiǎn)血清作為對(duì)照,膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性反應(yīng),否則為陰性反應(yīng)。布ELISA(CELISA)CELISA(Cloth-ELISA)是加拿大學(xué)者Blais,B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布(Hydrophobic Poly

18、ester Cloth)即滌綸布為固相載體,這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大,可為免疫反應(yīng)提供較大的表面積,提高反應(yīng)的敏感性,且容易洗滌,不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA類似,只是載體不同。以對(duì)布氏桿菌抗原的檢測(cè)為例,CELISA的主要程序?yàn)椋?首先把抗布氏桿菌的血清包被(吸附)在聚脂布上,并經(jīng)洗滌及封閉; 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘,然后洗5次; 加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體,于室溫下感作30分鐘,然后洗滌5次; 加入底物液顯色; 測(cè)定OD值。影響因素/酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 編輯酶聯(lián)免疫(ELISA)是如今檢驗(yàn)科常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法之一,其操作簡(jiǎn)單,無(wú)須特殊設(shè)備,使其在各

19、級(jí)醫(yī)院都有應(yīng)用。但是,如果忽視了影響其結(jié)果的因素,難免會(huì)造成假陰性或假陽(yáng)性,因此,了解影響實(shí)驗(yàn)的因素,減少差錯(cuò)事故的發(fā)生是極其必要的。素質(zhì)因素實(shí)驗(yàn)室人員的素質(zhì)主要包括五個(gè)方面:思想素質(zhì)、文化素質(zhì)、技術(shù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體素質(zhì)。首先應(yīng)具備一個(gè)良好的思想素質(zhì),因?yàn)槲覀兊姆?wù)對(duì)象是人,我們的道德水平直接關(guān)系到人們的健康和生命安危,如果馬馬虎虎。三心二意,難免會(huì)有差錯(cuò)事故發(fā)生,我們應(yīng)該熱愛(ài)專業(yè),耐心細(xì)致。在工作中如標(biāo)本混淆、張冠李戴、報(bào)告單發(fā)錯(cuò)等都有可能造成嚴(yán)重后果;其次文化素質(zhì)和技術(shù)素質(zhì),我們要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術(shù),認(rèn)真學(xué)習(xí)新理論新知識(shí),努力提高自己的業(yè)務(wù)水平,創(chuàng)造一個(gè)能夠勝任本職工作的技術(shù)平臺(tái)。良好的心理素質(zhì)就是要勇于面對(duì)工作生活中的挫折,在繁忙工作中,有條不紊,冷靜沉著的處理有關(guān)事務(wù)。人員素質(zhì)問(wèn)題是影響檢驗(yàn)結(jié)果的首要因素。標(biāo)本處理因素實(shí)驗(yàn)室人員收到標(biāo)本后應(yīng)認(rèn)真查對(duì),對(duì)不符合要求的標(biāo)本和申請(qǐng)單要拘收,合格標(biāo)本要及時(shí)分離血清,避免溶血,提取血清時(shí)不應(yīng)混有大量纖維蛋白或細(xì)胞成分。對(duì)不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本要妥善

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