實(shí)驗(yàn)3 ELISA法測(cè)定乙肝ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)七 ELISA法測(cè)定乙肝：是指用可微量測(cè)定的標(biāo)記物（放射性核素、熒光素、酶等）對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，并在標(biāo)記免疫物質(zhì)反應(yīng)結(jié)合后，測(cè)定結(jié)合物中的標(biāo)記物來反映抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)。 目前最常用的是酶標(biāo)記免疫技術(shù)、熒光標(biāo)記免疫技術(shù)、放射性核素標(biāo)記技術(shù)。這類免疫標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用極大程度地提高了抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)敏感性。1;.酶標(biāo)記免疫技術(shù)以酶作為標(biāo)記物，通過顯色反應(yīng)指示抗原-抗體反應(yīng)的標(biāo)記技術(shù)稱為酶免疫技術(shù)。 可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測(cè)定技術(shù)兩大類。目前應(yīng)用最廣的為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）,是免疫測(cè)定技術(shù)的代表。

2、2;.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）3;. 掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法和結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?;. 將抗原（或抗體）結(jié)合于某種固相載體的表面，并保持免疫活性，再以標(biāo)本中的待檢抗體（或抗原）與之結(jié)合，然后使酶標(biāo)抗體與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，分別洗去未結(jié)合的抗原與抗體，最后加入酶反應(yīng)的底物，出現(xiàn)呈色反應(yīng)，該反應(yīng)中的有色產(chǎn)物含量與待檢抗體（抗原）的含量直接相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：5;.ELISA測(cè)定方法有：間接法：檢測(cè)抗體最常用的方法；雙抗體夾心法：檢測(cè)抗原最常用的方法；競(jìng)爭法：既可用于測(cè)抗原，又可用于測(cè)抗體；6;.（1）間接法測(cè)定抗體A. 將抗原

3、吸附于固相載體表面(試劑盒生產(chǎn)廠家已經(jīng)做好）；B.加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物 ; C. 加酶標(biāo)抗體（多為37孵育） ；D.洗液洗去多余 未結(jié)合酶標(biāo)抗體E.加底物,顯色反應(yīng)， 測(cè)定底物的降解量和抗體量有關(guān)。 7;.（2）雙抗體夾心法測(cè)定抗原A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體; D. 洗液洗去多余 未結(jié)合酶標(biāo)抗體E. 加底物顯色。底物的降解量與抗原量有關(guān)。 8;. （3）競(jìng)爭法測(cè)定抗原A. 將抗體吸附在固相載體表面; B.加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。9;.乙

4、型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒 測(cè)定原理： 采用單克隆抗-HBs（ HBs Ab）包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入多克隆抗HBs-HRP（辣根過氧化物酶）,當(dāng)標(biāo)本中存在HBs Ag時(shí)，該HBs Ag與包被抗-HBs結(jié)合并與抗HBs-HRP結(jié)合形成抗-HBs- HBs Ag-抗HBs-HRP復(fù)合物，加入顯色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無顯色反應(yīng)。10;.試劑盒組成：1.包被好的微孔反應(yīng)板2.酶結(jié)合物3.陽性對(duì)照4.陰性對(duì)照5.洗滌液6.顯色劑A、B11;.測(cè)定步驟1.每孔加入待測(cè)樣本50l，設(shè)陰性、陽性對(duì)照孔，每孔加入陰性對(duì)照（或陽性對(duì)照）各一滴，并設(shè)空白對(duì)照1孔。2.每孔加入

5、酶結(jié)合物一滴（空白對(duì)照孔除外），充分混勻封板，置37孵育30分鐘。3.手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇5次程序洗板后拍干。4.每孔加入顯色劑A、B液各一滴，充分混勻，封板，置37 孵育15分鐘。5.用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm,先用空白孔較零，然后讀取各孔OD值。12;.結(jié)果判斷：判斷為陽性，否則為陰性。陰性對(duì)照OD值低于0.05時(shí)作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。樣品OD值陰性對(duì)照平均OD值2.113;.HBV抗原抗體檢測(cè)結(jié)果的臨床分析HBsAgHBeAg抗-HBs抗-HBe抗-HBc結(jié)果分析 HBV感染或無癥狀攜帶感染或

6、無癥狀攜帶 急慢性乙肝或無癥狀攜帶急慢性乙肝或無癥狀攜帶 急慢性乙肝（大三陽）急慢性乙肝（大三陽） 趨于恢復(fù)（小三陽）趨于恢復(fù)（小三陽） 既往感染恢復(fù)期既往感染恢復(fù)期 感染過感染過HBV 既往感染或接種過疫苗既往感染或接種過疫苗14;.酶標(biāo)板15;.酶標(biāo)儀16;. ELISA法有哪幾種類型？其原理是什么？ ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ ELISA的結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用？ 思考題17;.膠體金技術(shù)（金標(biāo)法） 氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的

7、雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層離子層H 則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。 膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。 免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電