釀酒酵母的發(fā)酵過程優(yōu)化

1、釀酒醉母的發(fā)醉過程優(yōu)化戴璐（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，常熟 215500）摘要：該文以釀酒酵母為的生產(chǎn)菌，通過發(fā)酵過程的優(yōu)化，重點(diǎn)考察了pH、溶解氧，測定殘?zhí)橇亢蜕锪康挠绊懀⒈容^了分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)對釀酒酵 母生長代謝的影響。發(fā)現(xiàn)補(bǔ)料分批培養(yǎng)比分批培養(yǎng)有利于釀酒酵母的生長與繁 殖，有較多的細(xì)胞生物量的積累。關(guān)鍵詞：釀酒酵母；發(fā)酵過程Wine yeast fermentation process optimizationDailu(Changshu Institute of TechnologyBiotechnology and Food Engineering Institute

2、,Changshu 215500)Abstract: The fermentation process ofSaccharomyces cerevisiaes optimized. The effect of some ferment conditions, including pH, fermentation of oxygen, determination of residual sugar and biomass are researched.And this experiment is the partial training, filling materials for partia

3、l training s.cerevisiae growth metabolic effects. The results showed that the partial training for material of s.cerevisiae training to of the growth and reproduction, more cells biomass accumulation.Key words: Saccharomyces cerevisiaeFerment Process釀酒酵母菌屬于真菌界、子囊菌門、不完全子囊菌綱、酵母菌目、酵母菌科、 酵母菌屬（Saccharomy

4、ceS。酵母菌屬含有若干種,如釀酒酵母菌（S. cerex isia。 和波蘭地酵母菌（S. boullard ii,新種未正式命名）1。酵母菌是重要的工業(yè)微生物與科學(xué)研究的模式生物，在食品、醫(yī)藥、能源化工和環(huán)境治理等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價值。野生酵母資源的開發(fā)利用是發(fā)酵工業(yè)菌種 改良的基石，也是基因多樣性的重要來源。其中葡萄酒酵母在葡萄酒釀造過程中 起著至關(guān)重要的作用，將葡萄汁中的絕大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳，同時生成甘油、高級醇、醛、酯等代謝產(chǎn)物，直接影響葡萄酒的色澤、香氣及口感，決 定著葡萄酒的質(zhì)量，對葡萄酒特色的形成至關(guān)重要。釀酒酵母菌的發(fā)酵特性因菌 株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導(dǎo)致

5、利用的底物不同、 生成的化學(xué)物質(zhì)不 同，從而使發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味2o1材料與方法1.1材料1.1.1 試驗(yàn)菌株釀酒酵母1.1.2 培養(yǎng)基PDA（斜面、平板培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15-20g,水1000ml, 自然pH。制法：馬鈴薯去皮后，切成小塊，加水煮爛（煮沸 20-30min,能被玻 璃棒戳破即可），用4層紗布過濾，再加糖和瓊脂，加熱溶化后在補(bǔ)足水分至1000 ml, 121c滅菌 20min。種子培養(yǎng)基（YEPD培養(yǎng)基）：酵母粉10g,蛋白陳20g,葡萄糖20g,蒸儲 水 1000mL, pH6.0, 121c濕熱滅菌 20min。發(fā)酵培

6、養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基。1.1.3 器皿電子天平，燒杯，錐形瓶，量筒，試管，玻璃棒，培養(yǎng)皿，移液管等。1.2 釀酒酵母發(fā)酵工藝1.2.1 分批發(fā)酵將培養(yǎng)好的種子液以10% （v/v）接種量接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，180r/min, 30c培養(yǎng)14h,調(diào)節(jié)通氣量為3L/min。從發(fā)酵開始，每隔2h在線讀取發(fā)酵罐中 發(fā)酵液pH,及溶解氧量。1.2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵將培養(yǎng)好的種子液以10% （v/v）接種量接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，180r/min, 30c培養(yǎng)14h,調(diào)節(jié)通氣量為3L/min。在細(xì)胞生長的對數(shù)生長期中后期一次性添 加20g葡萄糖到發(fā)酵罐中。每隔2h在線讀取發(fā)酵罐中發(fā)酵液pH,及溶解氧量。1

7、.3 釀酒酵母發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y定1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：DNS法3,5-二硝基水楊酸試劑：甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10%氫氧化鈉溶液中，并用水稀釋至69ml, 在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255g灑石酸鉀鈉加到300m110%氫氧化鈉溶液中，再加入880m11%3,5二硝基水楊酸溶液。將甲乙二溶液混合既得黃色試劑，儲于棕色瓶中備用。在室溫放置7-10天以后使用。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg分析純的無水葡萄糖（預(yù)先在105c干燥至恒重），用少量 蒸儲水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，搖勻。濃度為1mg/m1<取9支25mm

8、X 250mm的試管，分別按下表加入試劑：將各管溶液混合均勻，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即用冷水冷卻到室 溫，再向每管加入21.5ml蒸儲水，搖勻。于520nm波長處測A值。以葡萄糖 mg數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。項(xiàng)目012345678葡錮糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6相當(dāng)于葡相糖量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸儲水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5-二硝基水楊酸試劑（ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.3.2 殘?zhí)橇繙y定發(fā)酵過程中每隔2 h取出

9、10ml發(fā)酵液測定殘?zhí)橇?。取樣時間分別為0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h。1.4 釀酒酵母發(fā)酵液生物量的測定1.4.1 生物量測定（重量法）發(fā)酵過程中每隔2 h取出10ml發(fā)酵液，3000r/min離心10min,棄上清液，濕 菌泥在80c下干燥24 h后稱量，測定生物量。取樣時間分別為0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h02結(jié)果與分析發(fā)酵中殘?zhí)橇?、pH、生物量隨時間的變化2.1 分批發(fā)酵培養(yǎng)2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖濃度(g/L )圖1分批發(fā)酵時葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2.1.2 發(fā)酵液的殘?zhí)橇俊H、生物量隨時間的變化表1分批發(fā)

10、酵發(fā)酵液的殘?zhí)橇俊H、生物量隨時間的變化時間h02468101214殘?zhí)橇?43.03936.08230.72410.1127.88-0.603-0.5280.104pH5.85.525.264.934.85.035.135.13生物量g/l01.331.251.51.533.253.75分批培養(yǎng)過程中發(fā)酵液pH、殘?zhí)橇考吧锪侩S時間的變化曲線* pH殘?zhí)菨舛?生物量(g/L)圖2分批發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH、殘?zhí)橇俊⑸锪侩S時間的變化曲線2.1.3 生長代謝特征分析：1 pH在0-8小時內(nèi)，由于釀酒酵母利用碳源即葡萄糖生成有機(jī)酸等中間代謝產(chǎn)物， pH一直下降；在8-14小時內(nèi)，由于碳源減少，酵

11、母利用氮源產(chǎn)生氨，發(fā)酵液pH 又上升，故pH是隨著培養(yǎng)時間、碳源量的變化而變化的。2殘?zhí)橇恳恢背尸F(xiàn)下降趨勢，但是在釀酒酵母的生長對數(shù)期殘?zhí)橇肯陆笛杆?，這是因?yàn)樯L對數(shù)期，微生物繁殖速度快，碳源被大量消耗；在釀酒酵母的生長衰亡期， 殘?zhí)橇炕静蛔?，這是因?yàn)樘荚椿颈幌拇M，無剩余碳源可被轉(zhuǎn)化為葡萄糖， 進(jìn)而被微生物利用。3生物量在整個發(fā)酵過程中一直處于上升趨勢。 在釀酒酵母的生長平衡期和生長衰亡 期，生物量上升速度快，這是由于在這兩個時期微生物大量累積代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致生物量的上升。2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3補(bǔ)料分批發(fā)酵時葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線O2HA876543210分批補(bǔ)料培養(yǎng)的

12、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線0.20.40.60.811.21.41.61.8葡萄糖量（m。2.2.2 發(fā)酵液的殘?zhí)橇繗執(zhí)橇?、pH、生物量隨時間的變化表2補(bǔ)料分批發(fā)酵發(fā)酵液的殘?zhí)橇?、pH、生物量隨時間的變化數(shù)據(jù)時間h02468101214殘?zhí)橇?59.12459.99540.58016.46413.8524.1013.6654.710pH6.35.275.074.814.384.264.44.45生物量g/l331.12.24.23.34.54圖4分批發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH、殘?zhí)橇?、生物量隨時間的變化曲線分批補(bǔ)料培養(yǎng)過程發(fā)酵液pH、殘?zhí)橇考吧锪侩S時間的變化曲線pHT-殘?zhí)菨舛壬锪縢/L2.2.3 生長代謝

13、特征分析1pH在0-10小時內(nèi)，由于釀酒酵母利用碳源即葡萄糖生成有機(jī)酸等中間代謝產(chǎn)物，pH 一直下降，但是在分批發(fā)酵中 8小時以后pH開始上升，在補(bǔ)料分批發(fā) 酵過程中，由于又添加了葡萄糖，酵母繼續(xù)產(chǎn)生有機(jī)酸，pH繼續(xù)下降，直到10小時以后碳源消耗殆盡，酵母利用氮源產(chǎn)生氨，發(fā)酵液pH又上升。2殘?zhí)橇恳恢背尸F(xiàn)下降趨勢，但是在釀酒酵母的衰亡期殘?zhí)橇肯陆笛杆?，生長對數(shù)期下降緩慢，是由于一部分細(xì)胞死亡減少了其它細(xì)胞的競爭導(dǎo)致的。3生物量在生長初期保持不變可能是由于細(xì)胞個體發(fā)育適應(yīng)環(huán)境的一個過程。之后的 下降可能是由于有些細(xì)胞生長迅速消耗營養(yǎng)物質(zhì)多導(dǎo)致種齡大的細(xì)胞競爭力弱而死亡。但是生物量總體還是上升的，

14、這是由于微生物大量累積代謝產(chǎn)物的原因通過比較釀酒酵母在分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)兩種發(fā)酵方式下發(fā)酵液中的 pH、溶解氧及殘?zhí)橇亢蜕锪浚贸龅慕Y(jié)論為補(bǔ)料分批培養(yǎng)是培養(yǎng)酵母細(xì)胞較 為優(yōu)化的方式。由分批培養(yǎng)看出在發(fā)酵了 6h時葡萄糖含量最低，在此時向發(fā)酵液中加入一 定量的葡萄糖，可以延緩發(fā)酵液中殘?zhí)橇康臏p少速度， 縮短細(xì)胞的衰退期，產(chǎn)生 更多的酵母細(xì)胞。分批補(bǔ)料式培養(yǎng)能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，延長微生物生長期的時間使其快速生長，可以節(jié)約上產(chǎn)時間。文獻(xiàn)結(jié)果表明，當(dāng)溫度在 30c時，酵母的生長代謝量都達(dá)到最大，此時酵 母體內(nèi)酶活力達(dá)到最大或者由于設(shè)置溫度梯度大，未準(zhǔn)確測出其最適溫度。在較高溫度下，

15、酵母細(xì)胞發(fā)生自溶3,菌數(shù)減少，代謝相應(yīng)降低。在測定 pH對酵母 生長代謝影響中發(fā)現(xiàn)，最適pH值為5時，酵母的菌數(shù)最多，此時酵母對營養(yǎng)物 質(zhì)的吸收狀況最佳，體內(nèi)酶活力達(dá)到最大4。pH值為6時，酵母產(chǎn)生的酒精量 最多，可能此時酵母生長速率慢，利于酵母發(fā)酵。從培養(yǎng)基生長曲線看，麥汁培 養(yǎng)基濃度為1l° BX時，酵母生長代謝最快，11 0 BX的麥汁提供了足夠的碳源、 氮源等營養(yǎng)物。當(dāng)為12。BX的培養(yǎng)基時，可能過多的養(yǎng)分促進(jìn)酵母的絮凝，因 而生長代謝減慢。鈣離子在對酵母生長影響時，可能維持細(xì)胞內(nèi)外電荷處于穩(wěn)態(tài)， 或以其作為信號傳遞的信號物質(zhì)，從而有利于細(xì)胞生長代謝 5。酵母最適生長鈣 離子

16、濃度為0.14 g L-1 ,最適代謝鈣離子濃度為0.07 g L-1,可能生長時細(xì)胞耐受 力強(qiáng)于代謝期。從酒精對酵母生長代謝的影響來看，最適生長酒精濃度為1%,而最適代謝酒精濃度為0%。因?yàn)樯L時培養(yǎng)基中有一定的酒精存在可以抑制細(xì) 胞進(jìn)行產(chǎn)生代謝6。在沒有酒精存在時，無反饋抑制作用，所以代謝產(chǎn)物產(chǎn)生多。 酵母最佳生長條件是：溫度30 C, pH值為5,麥汁培養(yǎng)基濃度為1I0 BX,鈣離 子濃度為0.14 g - L-1,酒精濃度為1%;而酵母最適代謝條件略有不同，pH值 為6,鈣離子濃度為0. 07 g - L-1 ,酒精濃度為0%。高于或低于上述條件，酵 母生長代謝就會受到抑制7。所以可以根據(jù)這些條件來進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。1夏曉華，朱建國.釀酒酵母菌的生物學(xué)特性J.浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,5(3):27.2李華.現(xiàn)代葡萄酒工藝學(xué)M.西安：陜西人民出