重組DNA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

1、實驗報告題目:單元三:重組DNA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達指導(dǎo)老師：鄧慶麗日期:2013/10/31-201311/1一.實驗?zāi)康模?1) 了解和掌握IPTG誘導(dǎo)表達的原理和操作方法。(2) 了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機理。二.實驗原理：本實驗使用的是載體是已重組好的pGFPuv ,宿主細胞為大腸桿菌，目的基因的產(chǎn)物為融合蛋白，目的蛋白為綠色熒光蛋白 GFP非目的蛋白即融合部分為標(biāo)簽6X His,用于單元 四的親和層析分析。本實驗采用的啟動子為可調(diào)控的強啟動子乳糖操縱子lac。操縱子是原核基因表達的協(xié)調(diào)單位。通常由2個以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子

2、由三個結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A和操縱序列、啟動子、CAP結(jié)合位點等調(diào)節(jié)序列組成，如下圖 1所示：啟動子阻遏基因摻止子CAP的合位點啟動子懶縱序列結(jié)構(gòu)基因 a|ad產(chǎn)乙A4日-半乳糖首酶aY：透性酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶“圖I.乳精操縱子的結(jié)構(gòu)示意圖乳糖操縱子的調(diào)節(jié)包括誘導(dǎo)效應(yīng)和降解物阻遏效應(yīng)。（1）誘導(dǎo)表達當(dāng)沒有乳糖存在時，調(diào)節(jié)基因lacI表達，轉(zhuǎn)錄的 mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結(jié)合，阻礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動，使目的基因（本實驗中的綠色熒光蛋白基因 GFP不能轉(zhuǎn)錄，也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當(dāng)沒有乳糖 存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)，如下圖 2所示：啟動子

3、阻謁基因終止子CAP結(jié)合位點房初子榛縱序列 目的基因 f圖2.乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機制.當(dāng)有乳糖存在時，乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖， 異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，而不能結(jié)合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向 3'端移動，于是，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA,然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當(dāng)有乳糖存在時，乳糖操縱子被誘導(dǎo)，如下圖 3所示：啟動子阻遏基因熱止子CAP結(jié)合位點自動子操縱序列目的基因異乳糖"卜半乳精昔酶.乳糠圖3,乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機制-乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物。由于IPTG不會被分解， 它的誘導(dǎo)作用是持久的。(2)葡萄糖

4、降解物的阻遏作用代謝物基因激活蛋白(Catabolite gene Activation Protein ) CAP,又稱cAMP受體蛋白屬 于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進行正調(diào)節(jié)。CAP分子內(nèi)分別有 DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就可結(jié)合 DNA促進乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖降解物能抑制腺甘酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄。本實驗使用的表達載體 pGFPuv上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列， 目的基因表達的是帶 6 XHis的重組綠色熒光蛋白。在 IPTG的誘導(dǎo)下，融合蛋白表達可增強 105倍，并且可用金 屬螯合親和層析

5、分離純化，最終獲得純的重組綠色熒光蛋白。三.材料與試劑：(1)材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv(2)試劑LB 液體培養(yǎng)基 ：蛋白月東(tryptone) 10g、酵母粉(yeast extract) 5g、NaCl 10g,力口 800mL雙蒸水溶解，用 10M NaOH調(diào)pH至7.275,定容至1000mL。分裝，高壓滅菌，4 c保存。氨茉青霉素溶液：無菌雙蒸水配成100mg/mL,分裝，-20C保存，使用終濃度為 50 dg/mL 或 100g/mL。IPTG溶液(100 mM )：將238.3mg IPTG溶解于10mL雙蒸水，0.22科m細菌濾器過

6、濾 除菌，分裝，-20 C保存?zhèn)溆茫A存濃度為100 mM。20%葡萄糖溶液超聲平衡緩沖液：50mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH7.0四.實驗儀器：超凈工作臺、 低溫?fù)u床、高速冷凍離心機、超聲破碎儀等。五.實驗步驟、現(xiàn)象、結(jié)果及分析：1.工程菌的活化（10月30號教師準(zhǔn)備）分別挑取工程菌 BL21（DE3232a 和BL21（DE3）pGFPuv 的單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含氨節(jié)，終濃度為100wg/mL,以卜.同）晚上7點接種37 C、250rpm培養(yǎng)14h過夜至對數(shù)生長期第二天早上9點 左右取出放入4 C備用2.放大（10月31號）往裝于500ml三角瓶中的1

7、70ml LB液體培養(yǎng)基中加入 170dL Amp,搖勻，取三支滅 菌試管，用5ml槍各加入5ml LB液體培養(yǎng)基（含氨節(jié)），分別編號為1#, 2#, 3#,剩下的 裝于三角瓶中的液體培養(yǎng)基（含氨節(jié)），編號6#,全部按1: 50的比例接種菌種，操作如下：1# 接種 100dLBL21(DE3)p32a2#接種 100科LBL21(DE3)pGFPuv3#接種 100科LBL21(DE3)pGFPuv6#接種3mL BL21(DE3) pGFPuv下午接種于37C、250rpm培養(yǎng)約2h ,順便配制單兀四蛋白質(zhì)純化及電泳所需試劑。3.誘導(dǎo)1#、 2#不需處埋3#加入20%葡萄糖250 L, 至終

8、濃度為1.0%;加入25 dL 100mM IPTG 至終濃度為 0.5mM。6#加入100mM IPTG 約750科L至終 濃度為0.5mM。于25C、250rpm培養(yǎng)過夜4.收菌（注意米集標(biāo)本并編號）（11月1號早上9點開始）從6#三角瓶培養(yǎng)的150mL菌液中取出5mL置于 ,支試管中（編號為 4#）。分別從2 # , 3#, 4#養(yǎng)物各取100 dL于EP管 用于電泳。（相應(yīng)編號為S2,S3,S4）。（2）將1#, 2 # , 3#, 4#試管中的菌液分別收集到 4 個1.5mLEp離心管中（收3次），編上相應(yīng)編號。1#, 2 # , 3#離心棄上清（10000rpm離心1min） ;

9、4#第三 次離心后上清液收集到另一個 Ep管，編號為5#。6#三角瓶中剩余菌液用兩管50mL 離心管丁 8000rpm, 4C,離 心5min,棄上清收集菌體。5.觀察及超聲破碎于紫外燈下觀察1# -5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光(熒光強弱) ，記錄觀察 到的現(xiàn)象，并拍照。結(jié)果如下圖一所示：圖一：1# -5#管紫外觀察結(jié)果，從左到右依 次為1# -5#管。(1)全部菌體用50ml超聲平衡緩沖液重 懸(50mmol/L Tris-HCl , 500mmol/L NaCl pH7.0),即每管用25ml超聲緩沖 液重懸，用槍吹散，后倒入 50ml燒杯 中，置于裝滿碎冰的1L燒杯中，使小

10、燒杯高出大燒杯1cm左右，便于超破時 觀察菌液液面。(2)超聲波破菌，破碎之前測得。函為0.381 ,三周期后測得 ODoo為0.134, 然后用50ml離心管收集并于8000rpm , 4C,離心10min ,取上清(棄沉淀)， 保存于-20 C冰箱，下周層析實驗備用。六.思考與討論(1)對紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。答：圖一中從左到右依次為 1# -5#管，可以看出4#管綠色熒光最強，2#次之，其余1#、 3#、5#均無顏色。原因是1#管中質(zhì)粒為非重組質(zhì)粒 p32a,不含GFP,因而無法表達產(chǎn)生綠 色熒光蛋白，為陰性對照；2#管-4#管中大腸桿菌均含重組質(zhì)粒pGFPuv, 2#管中未經(jīng)誘

11、導(dǎo)，綠色熒光蛋白為本底水平的表達，因而顯示出淡淡的綠色熒光；4#管中經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)表達，GFP產(chǎn)量很高，因而顯示出很深的綠色熒光；而3#管雖然加入了 IPTG進行誘導(dǎo)表達，但是還加入了濃度為 1%的葡萄糖，導(dǎo)致cAMP 濃度降低，從而抑制了乳糖操縱子上游的激活位點， 抑制了乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄， 因而無法產(chǎn) 生綠色熒光；5#管為4#管最后一次離心的上清液，因菌體未破碎，因而上清液中不含GFP,因而也就無法產(chǎn)生綠色熒光。(2)為什么誘導(dǎo)表達的大腸桿菌要在其OD0。濃度約為0.5時加入IPTG?答：大腸桿菌要在其 OE。濃度名勺為0.5時基本進入對數(shù)生長期，菌體生長旺盛，增殖 快，對誘導(dǎo)表達而言，會有一個比較好的收率。若濃度較低時，菌體吸收的營養(yǎng)都用于表達 外源蛋白，勢必會嚴(yán)重影響它的繁殖，菌體量少了，總的外源蛋白表達量也會變少，當(dāng)在對