昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科課件

1、 酶免疫技術酶免疫技術放射免疫技術放射免疫技術發(fā)光免疫技術發(fā)光免疫技術酶免疫技術酶免疫技術三大經(jīng)典標記技術酶免疫技術酶免疫技術-三大經(jīng)典標記技術之一三大經(jīng)典標記技術之一三大經(jīng)典標記技術：三大經(jīng)典標記技術：抗原抗體反應的特異性抗原抗體反應的特異性+酶高效催化反應的專一性酶高效催化反應的專一性酶免疫技術的酶免疫技術的原理及特點原理及特點鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTSABTS常用底物常用底物酶免

2、疫技術的核心組成部分酶免疫技術的核心組成部分 酶結合物酶結合物（conjugateconjugate）酶標記物酶標記物 通過化學反應或免通過化學反應或免疫學反應，讓酶與疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的抗體或抗原形成的結合物結合物 酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完整抗原要求純度高，抗原性完整 抗體需要特異性好、效價高、親抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。產(chǎn)，易純化。 制備方法要求制備方法要求酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原制備方法要求制備方法要求技術方法簡單、產(chǎn)率高，重復性技術方法簡單、產(chǎn)率高，重復性好好標

3、記反應不影響酶和抗原或抗體標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性的活性酶標記物穩(wěn)定酶標記物穩(wěn)定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原制備方法制備方法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原 改良過碘酸鈉法改良過碘酸鈉法純化及鑒定純化及鑒定標記完成后應除去反應液中的游離酶、標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度作用而降低特異性染色強度 常用的純化方法：

4、常用的純化方法：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200/G-150G-200/G-150過柱層析純化過柱層析純化50%50%飽和硫酸銨沉淀提純飽和硫酸銨沉淀提純酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將游離和結合的酶標記物迅速分離的最常游離和結合的酶標記物迅速分離的最常用方法用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合到固相載體的表面到固相載體的表面 固相載體固相載體要求要求 結合抗體或抗原的容量大結合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原牢固地固定在其表面抗體或抗原牢固地固定在其表面 不影響免疫反應性不影響免疫反應性

5、利于反應充分進行利于反應充分進行 固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類種類塑料制品塑料制品 微顆粒微顆粒膜載體膜載體 固相載體固相載體將抗原或抗體結合于固相載體將抗原或抗體結合于固相載體用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附特異性吸附包被包被coatingcoating封閉封閉blockingblocking包被與封閉包被與封閉酶酶免免疫疫技技術術酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均均 相相非均相非均相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免

6、疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位組織切片或其它標本中抗原的定位 液體標本中抗原或液體標本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理原理均相酶免疫測定均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術最具代表性的兩種技術酶放大免疫測定技術酶放大

7、免疫測定技術EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫測定均相酶免疫測定與均相不同與均相不同之處之處需分離游離與結合的酶標記物需分離游離與結合的酶標記物非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應反應加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標抗原抗原和酶標抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結合在固相上使結合在固相上的抗原抗體復合物的抗原抗體復合物與未結合的分離與未結合的分

8、離1234一、基本原理一、基本原理固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標記物（酶結合物酶標記物（酶結合物） 酶反應的底物酶反應的底物 三個必要試劑三個必要試劑 二、方法類型及反應原理二、方法類型及反應原理雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色標抗體，加底物顯色應用：應用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 常用于檢測乙型肝炎表面抗原和常用于檢測乙型肝炎表面抗原和e e抗原等抗原等ELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原+ +- -E

9、 EE EE EE EE EE EE EE EE EELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法競爭法測抗原競爭法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標抗抗原與酶標抗原競爭與抗體原競爭與抗體結合結合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底物不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面2 2、加待測物、加待測物和酶標抗原，和酶標抗原，酶標抗原與抗酶標抗原與抗體結合體結合E E1 1、間接法、間接法方法方

10、法 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgGIgG（抗（抗抗體或二抗）加底物顯色?？贵w或二抗）加底物顯色。優(yōu)點優(yōu)點 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用應用 常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法間接法測抗體間接法測抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2 2、雙抗原夾心法、雙抗原夾心法原理：原理：類似雙抗體夾心法類似雙抗體夾心法操作步驟操作步驟：類似類似 應

11、用：應用：乙型肝炎表面抗體乙型肝炎表面抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法4 4、捕獲法、捕獲法 應用：應用： 病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗體型抗體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測標本中捕獲待測標本中IgMIgM類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標記特加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 捕獲法原理捕獲法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測物、加待測物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結合結合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結合性抗體結合4