黃酮的提取方案

1、黃酮提取實(shí)驗(yàn)方案1材料與儀器1.1 材料1.2 試齊IJ蘆丁，無水乙醇，氫氧化鈉，石油醒，硝酸鋁，三氯化鐵，三氯化鋁，濃氨水，濃鹽酸，鎂粉，亞硝酸鈉（以上均為國產(chǎn)分析純），實(shí)驗(yàn)所用水均為蒸儲水。1.3 實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫水浴鍋電子天平（感量 0.0001g ）722型光柵分光光度計(jì)索氏提取器量筒（100ml,10ml ） 25ml比色管 移液管 小試管 白瓷板圓底燒瓶 100m 容量瓶錐形瓶2實(shí)驗(yàn)原理2.1提取原理溶劑提取原理游離黃酮黃酮菩備注乙醇溶解范圍廣+（甲醇）昔、谷元均可溶（ 90-95%） （60%）甲醇毒性大沸水 多糖苔易于水+成本低，安全，水溶性雜質(zhì)多堿性水或稀氫氧化鈉溶出能力強(qiáng)堿

2、性乙醇 盼羥基的酸性 +石灰水除雜質(zhì)效果好ij萃取法分離依據(jù)分離工藝乙酸乙醋回收回收多糖普游離黃酮的乙醛液黃酮與雜質(zhì) 昔與昔元 菩元與百元酸化-0H黃酮之間的極性（分配系數(shù)K）4%NlOH液母液 t（脂溶性雜質(zhì)）H黃酮依次以5%NaHC(h , 5%NajCO30.2%N&0H、4%NaOH萃?。ǘ﹑H梯度萃取法分離依據(jù)：游離黃酮類化合物的酸性差異（見黃酮酸性規(guī)律） 分離工藝：C03液5%Na2CO3液 0. 2%N這0H液石油醍液 乙醛液 （脂溶性雜質(zhì)）|水飽和正丁醇 母液（水溶性雜質(zhì)） 減壓回收原料的提取冷縮液（水溶液） 依次以石油醒、乙醵、 乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取3 實(shí)驗(yàn)部

3、分3.1 原料的預(yù)處理金星科厥類葉f除雜-水洗-晾干-粉碎3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制將蘆丁在干燥箱里用120條件下恒重1.5h, 然后精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.01g 用85%的乙醇溶液配制成100.00mL 的溶液，備用。3.3 測定波長的選擇精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL, 置于 25.00mL 的比色管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇稀釋到10.00mL 處， 加人5%的亞硝酸鈉溶液0.80mL, 混勻， 放置 10min; 加入10%硝酸鋁溶液0.80mL , 混勻，放置 10min, 再加入4%的氫氧化鈉溶液10.00mL, 混勻，放置10min, 加入85%的乙醇溶液至刻度，搖勻，10m

4、in后在460560nm處測定吸光度，4 （以試劑樣品做空白）選擇最大吸收波長。3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乙醇稀釋到10.00mL 處，加人5%的亞硝酸鈉溶液0.80mL, 混勻，放置10min; 加入 10%硝酸鋁溶液0.80mL , 混勻， 放置 10min, 再加入4%的氫氧化鈉溶液10.00mL, 混勻， 放置 10min，加入85%勺乙醇溶液至刻度，搖勻， 10min后于波長500nm處測定吸光度，（以第一瓶為空白溶液）然后以吸光度和蘆丁溶液濃度做圖

5、，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.5 黃酮類化合物的特征性實(shí)驗(yàn)5-6在一定條件下對提取的黃酮類化合物進(jìn)行特征性實(shí)驗(yàn)，具體內(nèi)容如下：（ 1） 鹽酸鎂粉反應(yīng)：取1.00mL 提取液于試管中加適量鎂粉搖勻，再加入濃鹽酸數(shù)滴（1 次加入），觀察其泡沫顏色。（ 2） 三氯化鋁反應(yīng)：取提取液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干，觀察顏色變化。（ 3） 三氯化鐵反應(yīng)：取幾滴提取液于白瓷板上，滴加1%三氯化鐵乙醇溶液，觀察其顏色。（4） 濃氨水反應(yīng)：取乙醇提取液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)跐獍彼戏窖?.5min ，觀察其顏色變化。3.6 單因素實(shí)驗(yàn)2.6.1 較佳提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定準(zhǔn)確稱取3g 處理好的金星厥科葉樣品置于

6、圓底燒瓶中，分別用無水乙醇、 95%、 85% 80%、75%的乙醇60mL對3g金星厥科葉樣品在水浴溫度為80c下回流提取3h.提取完畢，用與提取劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同的乙醇反復(fù)洗滌圓底燒瓶、濾紙包，將其定容于100:00mL 容量瓶中，然后精確吸取0.50mL 提取液置于25.00mL 的比色管中，用與提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同的乙醇稀釋到10.00mL 處，加人5%的亞硝酸鈉溶液0.80mL, 混勻，放置10min; 加入10%硝酸鋁溶液0.80mL , 混勻，放置10min, 再加入4%的氫氧化鈉溶液10.00mL, 混勻，放置10min, 加入85%的乙醇溶液至刻度，搖勻，10min 后于波長50

7、0nm處測定其吸光度，同時做三組平行實(shí)驗(yàn)。2.6.2 較佳提取時間的確定準(zhǔn)確稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別用 2h、2.5h、3h、3.5h提取時 間用60mL 85%勺乙酉1對3g金星厥科葉樣品在水浴溫度為80c下回流提取，乙醇提取液的處理方法如前，測定其吸光度，同時做三組平行實(shí)驗(yàn)。2.6.3 較佳提取溫度的確定稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別在75C、80 C、85C、90 c的水浴溫度下用60mL 85%勺乙酉1對3g金星厥科葉樣品回流提取 2.5 h,乙醇提取液的處理方法如前，測 定其吸光度，同時做三組平行實(shí)驗(yàn)。2.6.4 較佳物料比的確定稱取3g

8、處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL的85%勺乙醇溶液在水浴溫度為85 c下對3g金星厥科葉樣品回流提取2.5 h,乙醇提取液的處理方法如前，測定其吸光度，同時做三組平行實(shí)驗(yàn)。2.6.5 素對黃酮類物質(zhì)的影響稱取15g金星厥科葉樣品放于錐形瓶中用 90mL的石油醛浸泡8個小時對其脫色，過濾、干燥。 然后準(zhǔn)確稱取處理過的 3g金星厥科葉樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 85%勺60mL乙醇溶液在水浴溫度為 85c下 對其回流提取2.5h ,乙醇提取液的處理方法如前，測定其吸光度，同時做三組平行實(shí)驗(yàn)。2.6.6 厥科葉中黃酮類化合物含量的測定精密量取石油醛處

9、理過的提取液0.50mL,置于25.00mL的比色管中。力口85%勺乙醇稀釋到10.00mL,加入5%勺亞硝酸鈉溶液 0.80mL,混勻，放置10min;加入10%5肖酸鋁溶液0.80mL,混勻， 放置10min,再加入4%勺氫氧化鈉溶液 10.00mL,混勻，放置10min,加入85%勺乙醇溶液至刻度， 搖勻，10min后于波長500nm處測定吸光度。同時做樣品空白管.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物中黃酮類化合物的含量.（把樣品所測得吸光度的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再算出0.50mL提取液中黃酮類化合物的濃度，然后再根據(jù)濃度算出樣品 中黃酮類化合物的百分含量.）計(jì)算方法（公式）如下：設(shè)樣品中黃酮類化

10、合物的含量為，稀釋以后的濃度為 C;原提取液的濃度為 C0 ;Co 100ml3.000g 1000100%Co =C VVo4結(jié)果與討論4.1 最大吸收波長的選擇將定量的黃酮提取液顯色以后在460560nm處測定吸光度，（以試劑樣品做空白）選擇最大吸收波長，測定結(jié)果如下：表1 波長與吸光度的關(guān)系波長（nm） 吸光度（A） 波長（nm） 吸光度（A）從表1中可以知道當(dāng)波長在什么時候有最大吸收波峰。4.2 產(chǎn)丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋、顯色以后在波長 500nm處測定吸光度（以第一瓶為空白溶液），以濃度 （c）為橫

11、坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)果如下：表2蘆丁溶液濃度與吸光度的關(guān)系濃度（mg/mL）0.0020.0040.0080.0120.016吸光度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃酮類化合物含量在0100ug/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=11.5548X-0.00406 R=0.99342,4.3 黃酮類化合物的特征性實(shí)驗(yàn)對所提取的黃酮類化合物進(jìn)行特征性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下表：表3定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果試劑現(xiàn)象鹽酸一鎂粉1%三氯化鋁1%三氯化鐵 濃氨水從表3可知，黃酮類化合物的特征性實(shí)驗(yàn)結(jié)果較符合黃酮類化合物的特征顏色反應(yīng)，證明所提取中含有黃酮類化合物。4.4 單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果4.4.1 較佳

12、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定準(zhǔn)確稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別用無水乙醇、95% 85% 80%、75%的乙醇60mL對3g金星厥科葉樣品在水浴溫度為80c下回流提取3h.顯色后測其吸光度，測定結(jié)果如下：表4不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對西山中黃酮類物質(zhì)提取的結(jié)果乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）無水乙醇95858075吸光度1吸光度2 吸光度3平均值4.4.2 較佳提取時間的確定準(zhǔn)確稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別用 2h、2.5h、3h、3.5h提取 時間用60mL 85%勺乙酉I對3g金星厥科葉樣品在水浴溫度為80c下回流提取。顯色后測其吸光度，測定結(jié)果如下：表5不同提取時間對西山中黃

13、酮類物質(zhì)的提取結(jié)果提取時間（h）22.533.5吸光度1吸光度2吸光度3平均值4.4.3 較佳提取溫度的確定稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別在75 C、80 C、85C、90 c的水浴溫度下用60mL 85%勺乙酉I對3g金星厥科葉樣品回流提取2.5 h。顯色后測其吸光度，測定結(jié)果如下：表6不同提取溫度對西山中黃酮類物質(zhì)的提取結(jié)果提取溫度（C）75808590吸光度1吸光度2吸光度3 平均值4.4.4 較佳物料比的確定稱取3g處理好的金星厥科葉樣品置于圓底燒瓶中，分別用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%勺乙醇在水浴溫度為 85c下對3g樣品回流提取2.5 h。顯色后測其吸光度，測定結(jié) 果如下：表7不同物料比對 金星厥科葉 中黃酮類物質(zhì)的提取結(jié)果物料比（w/v）1:101:151:201:251:30吸光度1吸光度2吸光度3平均值4.5 葉綠素對黃酮類物質(zhì)含量測定的影響準(zhǔn)確稱取用石油醛脫色過的3g金星厥科葉樣