PCR技術(shù)原理及心得.

1、PCR 技術(shù)原理與心得體會PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。一 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR 反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量 及活性 PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板:模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有 Taq 酶抑制劑,模板中蛋白質(zhì)沒有 消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固 定不

2、宜隨意更改。酶失活:需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠 而導致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR 失敗或擴增條 帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為:選定一個好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看 0D 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 PCR 有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮

3、度 低,在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長 期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引 物之間形成二聚體等。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對 PCR 擴增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR 擴 增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行 PCR 擴增采用的體積為 20ul、30ul、50ul。或 100ul, 應用多大體積進行 PCR 擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如 20ul后,再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對

4、 PCR 擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能 出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR 擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測 一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列 某段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。二假陽性,出現(xiàn)非特異性擴增帶1.假陽性出現(xiàn)的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，

5、因而在進行 PCR 擴增時，擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假 陽性。需重新設計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段 的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。 可互相拼接，與引物互 補后，可擴增出 PCR 產(chǎn)物,而導致假陽性的

6、產(chǎn)生，可用巢式 PCR 方法來減輕或消除。2出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴 增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因:一是引物與靶序列不完全互 補、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循 環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一 來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新 設計引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93C變性,65C左右退火與延 伸。3.

7、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR 擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或 酶的質(zhì)量差，dNTP 濃度過高,Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其 對策有:減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少 dNTP 的濃度。適當降低 Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。三. PCR 污染與對策PCR 反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因(一標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由 于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在 提取過程中

8、，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶 膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。匚 PCR 試劑的污染：主要是由于在 PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、 雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染.（三 PCR 擴增產(chǎn)物污染：這是 PCR 反應中最主要最常見的污染問題，因為 PCR產(chǎn) 物拷貝量 大（一般為 1013 拷貝/ml,遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染,就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液 體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時

9、、吸樣時及污 染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?48000 拷 貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題（四實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對 照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖 的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。四. 對照試驗1. 陽性對照:在建立 PCR 反應實驗室及一般的檢驗單位都應

10、設有 PCR 陽性對照,它是 PCR反應是否成功、 產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參 考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以 重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100 個拷貝以下，但陽性對照尤其是重組質(zhì) 粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設陽性對照。2. 陰性對照:每次 PCR 實驗務必做陰性對照。它包括標本對照：被檢的標本是 血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作 對照。試劑對照:在 PCR 試劑中不加模板

11、 DNA 或 RNA,進行 PCR 擴增,以監(jiān)測試 劑是否污染。3.重復性試驗4.選擇不同區(qū)域的引物進行 PCR 擴增五. 防止污染的方法（一合理分隔實驗室：將樣品的處理、配制 PCR 反應液、PCR 循環(huán)擴增及 PCR 產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及 PCR 產(chǎn)物的鑒定應與其它 步驟嚴格分開。最好能劃分標本處理區(qū)：PCR 反應液制備區(qū)；PCR 循環(huán)擴增區(qū)：PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū)。 其實驗用品及吸樣槍應專用，實驗前應 將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或 RNA。（二吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板 核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污

12、染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。（三預混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應小量 分裝，如有可能，PCR 反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20C保存。以減少 重復加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR 試劑，PCR 反應液應與樣品及 PCR 產(chǎn) 物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。（四防止操作人員污染，使用一次性 手套、吸頭、小離心管應一次性使 用。（五設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃?對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能 性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作 陰性對照。（六減少 PCR