重組DNA導入受體細胞

1、第三部分第三部分 重組重組DNADNA導入受體細胞導入受體細胞一、受體細胞一、受體細胞二、選擇受體細胞的基本原則二、選擇受體細胞的基本原則三、重組三、重組DNADNA導入受體細胞的方法導入受體細胞的方法1 1、轉化概念、轉化概念轉化轉化 ：DNA DNA 重組分子在體外構建完成后，必須導入重組分子在體外構建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱為或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱為重組重組 DNA DNA 分子的轉化（分子的轉化（TransformationTransfo

2、rmation）。）。重組重組DNA DNA 人工導入受體細胞有許多方法，包括人工導入受體細胞有許多方法，包括轉化、轉化、轉染、接合轉染、接合以及其它物理手段，如受體細胞的電穿孔以及其它物理手段，如受體細胞的電穿孔和顯微注射等，這些導入方法在和顯微注射等，這些導入方法在 DNA DNA 重組技術中統(tǒng)重組技術中統(tǒng)稱為轉化操作。稱為轉化操作。一、重組一、重組DNADNA轉化轉化感受態(tài)：感受態(tài)：受體細胞最易接受外源受體細胞最易接受外源 DNA DNA 片段而實現轉片段而實現轉化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細菌，其化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細菌，其吸收轉化因子的能力為一般細菌生理狀

3、態(tài)的千倍以上，吸收轉化因子的能力為一般細菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細菌間的感受態(tài)差異往往受自身的而且不同細菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。等諸多因素的影響。2 2、細菌轉化的步驟：、細菌轉化的步驟：感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細胞表面出現各種蛋感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細胞表面出現各種蛋白質和酶類，負責轉化因子的結合、切割及加工。白質和酶類，負責轉化因子的結合、切割及加工。感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細胞表面受體結合，誘導某受因子，其功能是與細胞表面受體結合

4、，誘導某些與感受態(tài)有關的特征性蛋白質（如細菌溶素）些與感受態(tài)有關的特征性蛋白質（如細菌溶素）的合成，使細菌胞壁部分溶解，局部暴露出細胞的合成，使細菌胞壁部分溶解，局部暴露出細胞膜上的膜上的 DNA DNA 結合蛋白和核酸酶等。結合蛋白和核酸酶等。轉化因子的結合。受體菌細胞膜上的轉化因子的結合。受體菌細胞膜上的DNADNA結合蛋結合蛋白可與轉化因子的雙鏈白可與轉化因子的雙鏈DNADNA結構特異性結合，單鏈結構特異性結合，單鏈DNADNA或或RNARNA雙鏈雙鏈RNARNA以及以及DNA/RNADNA/RNA雜合雙鏈都不能結雜合雙鏈都不能結合在膜上。合在膜上。轉化因子的吸收。雙鏈轉化因子的吸收。雙

5、鏈 DNA DNA 分子與結合蛋白分子與結合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。另一條鏈則被吸收到受體菌中。整合復合物前體的形成。進入受體細胞的單鏈整合復合物前體的形成。進入受體細胞的單鏈 DNA DNA 與另一種游離的蛋白因子結合，形成整合復與另一種游離的蛋白因子結合，形成整合復合物前體結構，它能有效地保護單鏈合物前體結構，它能有效地保護單鏈DNADNA免受各免受各種胞內核酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色種胞內核酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色體體DNADNA處。處。轉化因子單鏈轉化因子單鏈DNADNA的整合

6、。供體單鏈的整合。供體單鏈DNADNA片段通片段通過同源重組，置換受體染色體過同源重組，置換受體染色體DNADNA的同源區(qū)域，的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈形成異源雜合雙鏈 DNADNA結構。結構。二、受體細胞二、受體細胞受體細胞受體細胞(receptor cell)：又稱為宿主細胞又稱為宿主細胞 (host cell)，是指能攝取外源，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞并使其穩(wěn)定維持的細胞感受態(tài)感受態(tài)(competence)：是指細菌吸收外源是指細菌吸收外源DNA的的生理狀態(tài)。生理狀態(tài)。感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞(competence cell)：是指具有接受外是指具有接受外源源DNA能力的細

7、胞。能力的細胞。1 1、原核生物細胞的優(yōu)點、原核生物細胞的優(yōu)點大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源胞壁，便于外源DNADNA的進入。的進入。沒有核膜，染色體沒有核膜，染色體DNADNA沒有固定結合的蛋白質，沒有固定結合的蛋白質，這為外源這為外源DNADNA與裸露的染色體與裸露的染色體DNADNA重組減少了麻煩重組減少了麻煩基因組簡單，不含線粒體和質體基因組，便于基因組簡單，不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。對引入的外源基因進行遺傳分析。原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致

8、性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。期短，重復實驗快。原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質折疊復性原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質折疊復性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達，得到的也系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達，得到的也多是無特異性空間結構的多肽鏈。多是無特異性空間結構的多肽鏈。原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質加工系統(tǒng)，原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質的生物活性正是依賴于其側而許多真核生物蛋白質的生物活性正是依賴于其側鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核生物細胞內

9、源性蛋白酶易降解空間構象不正原核生物細胞內源性蛋白酶易降解空間構象不正確的異源蛋白，造成表達產物不穩(wěn)定等。確的異源蛋白，造成表達產物不穩(wěn)定等。2 2、原核生物細胞表達真核生物基因存在的缺點：、原核生物細胞表達真核生物基因存在的缺點：3、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌等。菌、藍細菌等。大腸桿菌受體細胞大腸桿菌受體細胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載是基因

10、工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。體受體系統(tǒng)。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內毒素缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內毒素可導致人體熱原反應?？蓪е氯梭w熱原反應。枯草桿菌受體細胞枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌?？莶輻U菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點：優(yōu)點：枯草桿菌具有胞外酶分泌調節(jié)基因，能將具有表達的產枯草桿菌具有胞外酶分泌調節(jié)基因，能將具有表達的產物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達產物的提取和物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達產物的提取和加

11、工處理等，而且在大多數情況下，真核生物的異源重組蛋加工處理等，而且在大多數情況下，真核生物的異源重組蛋白經枯草桿菌分泌后便具有天然的構象和生物活性。白經枯草桿菌分泌后便具有天然的構象和生物活性?？莶輻U菌不產生內毒素，無致病性，是一種安全的基因工枯草桿菌不產生內毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌。程菌。枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調控、分子枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。遺傳學背景清楚等優(yōu)點。應用：已成功的用于表達人的應用：已成功的用于表達人的干擾素、白

12、細胞介素乙型干擾素、白細胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPIVPI抗原等?？乖?。藍細菌（藍藻）藍細菌（藍藻）藍藻藍藻又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素a(a(缺乏葉綠素缺乏葉綠素b)b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)(PS)(PS) 和光合系統(tǒng)和光合系統(tǒng)(PS)(PS)、能進行光合作用，但它又、能進行光合作用，但它又具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結構的細胞具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結構的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具

13、微生物和植藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現在：物的優(yōu)點，具體表現在：基因組為原核型，除了裸露的染色體基因組為原核型，除了裸露的染色體DNADNA外，不外，不含葉綠體含葉綠體DNADNA和線粒體和線粒體DNADNA，遺傳背景簡單，便于，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源基因操作和外源DNADNA的檢測。的檢測。細胞壁屬細胞壁屬G G- -，主要由肽聚糖組成，便于外源，主要由肽聚糖組成，便于外源DNADNA的轉化。的轉化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2CO2、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需、無機鹽、水和適宜的溫度就

14、能滿足生長需要。要。多種藍藻含內源質粒，為構建藍藻質粒載體提多種藍藻含內源質粒，為構建藍藻質粒載體提供了極好的條件。供了極好的條件。藍藻富含蛋白質，并且多數藍藻無毒，早已用藍藻富含蛋白質，并且多數藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎上采用轉基因技術，作食物或保健品，在此基礎上采用轉基因技術，把一些重要藥物的基因轉入無毒藍藻，就可達到把一些重要藥物的基因轉入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。錦上添花的效果。4 4、真核生物細胞、真核生物細胞真菌受體細胞真菌受體細胞真菌是低等的真核生物，其基因結構、表真菌是低等的真核生物，其基因結構、表達調控機制以及蛋白質的加工與分泌都具達調控機制以及蛋白質的

15、加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細胞表有真核生物的特征，因此利用真菌細胞表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。比擬的優(yōu)點。酵母菌酵母菌酵母菌作為外源真核基因表達系統(tǒng)的優(yōu)點酵母菌作為外源真核基因表達系統(tǒng)的優(yōu)點酵母菌是結構最為簡單的真核生物之一酵母菌是結構最為簡單的真核生物之一, ,其基因表達其基因表達調控機理比較清楚調控機理比較清楚, ,遺傳操作相對較為簡單。遺傳操作相對較為簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性的病毒，不產生毒素，有些酵母菌屬不含有特異性的病毒，不產生毒素，有些酵母菌

16、屬( (如釀酒酵母如釀酒酵母) )在儀器工業(yè)中有著幾百年的應用歷史，在儀器工業(yè)中有著幾百年的應用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產，成本低廉。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產，成本低廉。能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中，便于產物能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中，便于產物的提取和加工等。的提取和加工等。動物細胞動物細胞常用的動物受體細胞有常用的動物受體細胞有HelaHela細胞、猴腎細胞和細胞、猴腎細胞和中國倉鼠巢細胞中國倉鼠巢細胞(CHO)(CHO)等。等。哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點是：哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點是：能識別和除去外

17、源真核基因中的內含子，剪接能識別和除去外源真核基因中的內含子，剪接加工成成熟的加工成成熟的RNARNA。真核基因表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修真核基因表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾飾, ,產物具有較好的蛋白質免疫原性產物具有較好的蛋白質免疫原性, ,約為酵母細約為酵母細胞胞16-2016-20倍。倍。易被重組易被重組DNADNA質粒轉染質粒轉染, ,具有遺傳穩(wěn)定性和可重具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。復性。經轉化的動物細胞可將表達產物分泌到培養(yǎng)基經轉化的動物細胞可將表達產物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。中，便于提純和加工，成本低。缺點是缺點是: :組織培養(yǎng)技術要求高，如培養(yǎng)和篩選組織

18、培養(yǎng)技術要求高，如培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉化子一個高度擴增的轉化子CHOCHO細胞，通常需要數月細胞，通常需要數月之久之久, ,難度較大。難度較大。目前用作基因轉移的受體動物主要有豬，羊、目前用作基因轉移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用牛、魚等經濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產天然狀態(tài)的復雜蛋白質或途在于大規(guī)模表達生產天然狀態(tài)的復雜蛋白質或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。因治療等。常用的動物受體細胞有小鼠常用的動物受體細胞有小鼠L L細胞、細胞、HeleHele細胞細胞猴腎細胞

19、和中國倉鼠卵巢細胞猴腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(CHO)等。以動物等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點植物受體細胞植物受體細胞優(yōu)點：全能性，優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞在合適即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。定遺傳的植株或品系。 缺點：缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組胞壁，不利于攝取重組DNADNA分

20、子。分子?，F在用作轉基因受體的植物有水稻、棉花、現在用作轉基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經濟作物和擬南芥等模玉米、馬鈴薯、煙草等經濟作物和擬南芥等模式植物。式植物。 5 5、選擇受體細胞的基本原則、選擇受體細胞的基本原則便于重組便于重組DNADNA分子的導入。分子的導入。便于重組體的篩選。根據所用的表達載體所含的便于重組體的篩選。根據所用的表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從而易選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進行篩選。于對重組體進行篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高密度發(fā)酵而不影響外

21、源基因的表達效率。對動物密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。 受體細胞內內源蛋白水解酶基因缺失或蛋受體細胞內內源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產物在細白酶含量低，利于外源蛋白表達產物在細胞內積累，可促進外源基因高效分泌表達胞內積累，可促進外源基因高效分泌表達。安全性高，安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染成生物污染。一般選用致病缺陷

22、型的細胞。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞?；驙I養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞。能使重組能使重組DNADNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發(fā)，通常的做法是對其作適當的修飾胞的角度出發(fā)，通常的做法是對其作適當的修飾改造，如選用某些限制性核酸內切酶缺陷型的受改造，如選用某些限制性核酸內切酶缺陷型的受體細胞就可以避免其對重組體細胞就可以避免其對重組DNADNA分子的降解破壞分子的降解破壞作用。作用。受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性。受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性。具有較好的轉譯后加工機制等，便于真核目的基具有較好的轉譯后加工機制

23、等，便于真核目的基因的高效表達。因的高效表達。在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值。在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值。6 6、受體細胞應具備的條件、受體細胞應具備的條件野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身具野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性因此必須通過適當的誘變手段對野生型大腸桿菌進行因此必須通過適當的誘變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株通常應從以下幾個方面加以考慮：通常應從以下幾個方面加以考

24、慮：從安全性考慮，應具備以下條件：從安全性考慮，應具備以下條件：不適合在人體內生存不適合在人體內生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存在非培養(yǎng)條件下，其在非培養(yǎng)條件下，其DNADNA容易解體容易解體它的它的DNADNA不易轉移不易轉移它的質粒只在這一宿主由復制它的質粒只在這一宿主由復制便于檢測便于檢測 從遺傳性考慮：從遺傳性考慮：重組缺陷型重組缺陷型recArecA，用于基因擴增或高效表達的用于基因擴增或高效表達的受體細胞（受體細胞（recArecA- -）限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對外源對外源DNADNA的除解。外切酶和內切

25、酶活性缺陷的除解。外切酶和內切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hsdRhsdR- -） 與重組質粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與與重組質粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標記互補的表型）載體選擇標記互補的表型）具有較高的轉化效率具有較高的轉化效率 限制缺陷型限制缺陷型這是導致外源重組這是導致外源重組DNADNA轉化或轉導效率低下的主要轉化或轉導效率低下的主要原因之一。原因之一。應選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞應選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源，以提高外源DNADNA分子的轉化或轉導效率。分子的轉化或轉導效率。進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生

26、缺陷，則受體菌細胞既進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源不能修飾，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重組分子，更便于重組DNADNA分子的多種基因操作。分子的多種基因操作。大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由 hsdR hsdR 基因編碼，因基因編碼，因此具有此具有 hsdRhsdR- - 遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了降解外源降解外源DNADNA的能力，同時大大增加了外源的能力，同時大大增加了外源 DNADNA的的可轉化性?？赊D化性。重組缺陷型重組缺陷型進入野生型細胞的外源進入野生型細胞的外源DNADNA分子能自發(fā)地

27、與染色體分子能自發(fā)地與染色體DNADNA發(fā)生的體內同源重組反應由發(fā)生的體內同源重組反應由recrec基因家族的編碼產物所控基因家族的編碼產物所控制。制。RecARecA蛋白能促進蛋白能促進DNADNA分子之間的同源聯會和分子之間的同源聯會和DNADNA單鏈單鏈交換，交換，recArecA基因的突變使大腸桿菌細胞內的遺傳重組頻基因的突變使大腸桿菌細胞內的遺傳重組頻率降低至率降低至10106 6。大腸桿菌的大腸桿菌的 recBrecB、recC recC 和和 recD recD 基因分別編碼不同基因分別編碼不同分子量的多肽鏈，三者構成一個在同源重組中的統(tǒng)一功分子量的多肽鏈，三者構成一個在同源重組

28、中的統(tǒng)一功能單位能單位RecBCDRecBCD蛋白（核酸酶蛋白（核酸酶V V），它具有依賴于），它具有依賴于ATPATP的雙鏈的雙鏈DNADNA外切酶和單鏈外切酶和單鏈 DNADNA內切酶雙重活性。內切酶雙重活性。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率因此受體細胞必須選擇體內同源重組缺陷型的遺傳表型因此受體細胞必須選擇體內同源重組缺陷型的遺傳表型基因型為基因型為recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大腸桿菌突變體等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。菌

29、株則將三個基因同時失活。 轉化親和型轉化親和型可以利用遺傳誘變技術改變受體菌細胞可以利用遺傳誘變技術改變受體菌細胞壁的通透性及細胞膜的特異吸附性，從壁的通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其轉化效率。還可以選擇能夠誘而提高其轉化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細胞。胞。遺傳互補型遺傳互補型遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細胞呈現與載體所攜帶的選擇標記互補的使受體細胞呈現與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳性狀。方能使轉化細胞的篩選成為可能。遺傳性狀。方能使轉化細胞的篩選成為可能。如在大

30、腸桿菌系統(tǒng)中，重組質粒載體上多含有如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質粒載體上多含有AMPAMP抗性標記基因，則所選用的受體細胞應對這抗性標記基因，則所選用的受體細胞應對這種抗生素敏感。當重組種抗生素敏感。當重組DNADNA分子轉入受體細胞后分子轉入受體細胞后載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據此可以區(qū)分轉化子與非轉化子。征，據此可以區(qū)分轉化子與非轉化子。如果受體細胞具有與外源基因表達產物活性互補如果受體細胞具有與外源基因表達產物活性互補的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達的轉的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達的轉化細胞?；毎?。 感染寄生缺陷型感

31、染寄生缺陷型相當多的細菌對其它生物尤其是人和牲畜具有相當多的細菌對其它生物尤其是人和牲畜具有 感染和寄生效應，重組感染和寄生效應，重組 DNA DNA 分子導入這些細分子導入這些細 菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生 作用，進入生物體內，并廣泛圍傳播，作用，進入生物體內，并廣泛圍傳播，如果外源基因對人體和牲畜有害，則會導致一如果外源基因對人體和牲畜有害，則會導致一 場災難，因此從安全的角度上考慮，受體細胞場災難，因此從安全的角度上考慮，受體細胞 不能具有感染寄生性，當然，利用基因工程手不能具有感染寄生性，當然，利用基因工程手 段制造生物武器不在此例

32、。段制造生物武器不在此例。三、重組三、重組DNADNA導入受體細胞的方法導入受體細胞的方法轉化轉化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲質粒獲質粒DNA或以它為載體構建的重組質?；蛞运鼮檩d體構建的重組質粒DNA分分子的過程。子的過程。轉化子轉化子(transformant)：經轉化獲得外源遺傳物質經轉化獲得外源遺傳物質的細胞。的細胞。轉染轉染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲噬指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲噬菌體或以它為載體構建的重組菌體或以它為載體構建的重組DNA分子的過程分子的過程轉導轉導(transduction):指病毒轉

33、移真核細胞指病毒轉移真核細胞DNA的過的過程或噬菌體介導的細菌細胞之間基因轉移的過程。程或噬菌體介導的細菌細胞之間基因轉移的過程?；驅胧荏w細胞方法基因導入受體細胞方法根據轉移基因方法特性可分為：根據轉移基因方法特性可分為：轉化轉化(transformation)(transformation)轉導轉導(transduction)(transduction)轉染轉染(transfection)(transfection)微注射技術微注射技術(microinjection)(microinjection)電轉化法電轉化法(electroporation)(electroporation)基因槍

34、技術基因槍技術(geneblaster)(geneblaster)脂質體介導法脂質體介導法(liposome mediated transfer)(liposome mediated transfer)根據轉移基因載體與受體的特性可分為：根據轉移基因載體與受體的特性可分為：質粒載體導入受體細胞的方法：質粒載體導入受體細胞的方法：CaCl2、電轉化、電轉化法等。法等。噬菌體轉染細胞的方法：噬菌體轉染細胞的方法：體外包裝感染法等。體外包裝感染法等。DNA導入酵母菌的方法：導入酵母菌的方法：原生質體轉化、電穿孔原生質體轉化、電穿孔轉化法等。轉化法等。DNA導入植物細胞的方法：導入植物細胞的方法：Ti

35、質粒葉盤法、電穿質粒葉盤法、電穿孔轉化法、基因槍法等。孔轉化法、基因槍法等。DNA導入昆蟲細胞的方法：導入昆蟲細胞的方法：桿狀病毒感染法等。桿狀病毒感染法等。DNA導入哺乳動物細胞的方法：導入哺乳動物細胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉化法、脂質體介導法、基因槍法等電穿孔轉化法、脂質體介導法、基因槍法等1、氯化鈣轉化法、氯化鈣轉化法大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉化，其主要原因是轉化因子的吸收較為困進行轉化，其主要原因是轉化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應用中，轉化受體菌細胞難。在基因工程研究和應用中，轉化受體菌細

36、胞的正是根據人們需要構建的外源重組質粒的正是根據人們需要構建的外源重組質粒DNADNA分子分子而非來自供體菌的游離而非來自供體菌的游離DNADNA片段片段( (轉化因子轉化因子) )。因此在大腸桿菌的轉化實驗中，很少采取自然轉因此在大腸桿菌的轉化實驗中，很少采取自然轉化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉化處理，其中代表性備感受態(tài)細胞，然后進行轉化處理，其中代表性的方法之一是的方法之一是CaCa2+2+誘導的大腸桿菌轉化法。誘導的大腸桿菌轉化法。19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige

37、發(fā)現發(fā)現, ,大腸桿菌大腸桿菌經過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后經過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后, ,便能吸收便能吸收噬菌體噬菌體DNADNA。19721972年美國斯坦年美國斯坦福大學福大學 S.CohenS.Cohen報道報道, ,經氯化鈣處理大腸經氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質粒桿菌細胞也能攝取質粒DNADNA。CaCa2+2+誘導轉化原理：誘導轉化原理：在在00的的CaclCacl2 2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時脹，同時CaclCacl2 2使細胞膜磷脂層形成液晶結構使細胞膜磷脂層形成液晶結構促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離促使細胞外膜與內

38、膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。CaCa2+2+能與加入的能與加入的DNADNA分子結合，形成抗分子結合，形成抗DNADNA酶酶(DNase)(DNase)的羥基的羥基- -磷酸鈣復合物，并黏附在細菌磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當細胞膜的外表面上。當4242熱刺激短暫處理細熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，菌細胞時，細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現許多間隙，為并隨之出現許多間隙，為DNADNA分子提供了進入分子提供了進入細胞的通道。細胞的通道。 MgMg2+2+對對DNADNA分子有很大的穩(wěn)定性作

39、用，因此利用分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用MgclMgcl2 2與與CaclCacl2 2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNADNA的轉化效率。如利用二甲基亞砜的轉化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)(DMSO)和二和二硫蘇糖醇硫蘇糖醇(DDT)(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉化效率可提高感受態(tài)細胞的形成，轉化效率可提高10010010001000倍，且對大小質粒分子均可進行有效的轉化。倍，且對大小質粒分子均可進行有效的轉化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常

40、很少采用。通常很少采用。 該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉化轉化如果感受態(tài)細胞做得好，每微克超螺旋如果感受態(tài)細胞做得好，每微克超螺旋質粒質粒DNA可得可得51071109個轉化子。個轉化子。大腸桿菌感受態(tài)細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：的制備：100ml菌體培養(yǎng)至菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體。離心收集菌體。 用用10 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離溶液懸浮菌體，離心收集菌體。心收集菌體。用用1 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶

41、液懸浮菌體。溶液懸浮菌體。 冰浴放置冰浴放置12 - 24小時，備用小時，備用 。取取100 ml感受態(tài)細胞，加入相當于感受態(tài)細胞，加入相當于50 ng載體的載體的重組重組DNADNA連接液，混勻。連接液，混勻。冰浴放置半小時。冰浴放置半小時。 在在4242保溫保溫1.5 分鐘（熱脈沖）。分鐘（熱脈沖）。 快速將轉化細胞轉移至冰浴中放置快速將轉化細胞轉移至冰浴中放置1 2 分鐘。分鐘。 加入加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基，于于37培養(yǎng)培養(yǎng) 1 小小時（擴增）。時（擴增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。 獲得合格的感受態(tài)細胞，要注意以下幾點：獲得合

42、格的感受態(tài)細胞，要注意以下幾點：用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在一般在A600A600為為0.40.4左右為好。左右為好。制備受體細胞的整個過程要在制備受體細胞的整個過程要在0 044進行，并盡進行，并盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉化子，作為對照量避免污染。如果用抗生素篩選轉化子，作為對照的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。為了提高轉化率，可選用復合氯化鈣溶液，如為了提高轉化率，可選用復合氯化鈣溶液，如FSBFSB溶液。溶液。CaCl2CaCl2法制備感受態(tài)細胞轉化法制備感受態(tài)細胞轉化DNADNA時，低溫的

43、主要時，低溫的主要目的是目的是: :（1 1）抑制細胞的旺盛生理代謝。）抑制細胞的旺盛生理代謝。（2 2）有助于）有助于DNA-Ca2+DNA-Ca2+吸附于細胞表面。吸附于細胞表面。（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA。熱休克溫度是熱休克溫度是4242。目的是使細胞攝入吸附于其。目的是使細胞攝入吸附于其表面的表面的DNADNA。轉化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉轉化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉化子的出現，因此須設以下幾種對照處理：化子的出現，因此須設以下幾種對照處理：DNADNA對照處理。轉化處理液中用對照處理。轉化處理液中用0.2ml0.2ml

44、無菌水代替無菌水代替0.2m10.2m1感受態(tài)細胞，檢驗感受態(tài)細胞，檢驗DNADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。感受態(tài)細胞對照處理。轉化處理液中用感受態(tài)細胞對照處理。轉化處理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE緩沖液緩沖液(500mM NaCl(500mM NaCl，10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl，1mMEDTA1mMEDTApH8.0)pH8.0)代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。菌。感受態(tài)細胞有效性對照處理。在感受態(tài)細胞有效性對照處理。在0.2ml0.2ml感受態(tài)細感受態(tài)細胞中加入胞中加入0.1ml0.1

45、ml已知容易轉化這種感受態(tài)細胞的質已知容易轉化這種感受態(tài)細胞的質粒粒DNADNA。 2、PEG介導的細菌原生質體轉化介導的細菌原生質體轉化革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質體（細胞去壁后的形態(tài)）轉化的方法轉移用原生質體（細胞去壁后的形態(tài)）轉化的方法轉移質?；蛑亟M質?；蛑亟MDNA分子分子 。酵母菌、霉菌、植物細胞也可用酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質體法進行轉原生質體法進行轉化化。PEGPEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, , 存在不同分子量的

46、多聚體存在不同分子量的多聚體, ,它可改變各類細胞的膜結構它可改變各類細胞的膜結構, , 使兩細胞相互接觸部使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組, ,此時相互此時相互接觸的兩細胞的胞質溝通成為可能接觸的兩細胞的胞質溝通成為可能, ,從而造成細胞之從而造成細胞之間發(fā)生融合。間發(fā)生融合。細菌原生質體細菌原生質體的制備：的制備：不同細菌的原生質體制備方法不盡相同，以鏈霉菌不同細菌的原生質體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細菌需生長在為例：細菌需生長在高滲培養(yǎng)基高滲培養(yǎng)基中（如中（如34%的蔗糖的蔗糖溶液），并加入溶液），并加入甘氨酸甘氨酸以增加細

47、菌細胞壁對溶菌酶以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液的蔗糖等滲溶液中。與原生質體接觸的所有中。與原生質體接觸的所有器皿應保持器皿應保持無水無去污劑無水無去污劑。 細菌原生質體細菌原生質體的轉化：的轉化：取取0.2 - 1ml的原生質體懸浮液（的原生質體懸浮液（10108 8-10-109 9個原生質個原生質體），加入體），加入10 - 20 m ml DNA重組連接液，同時加重組連接液，同時加入含有入含有PEG1000和和Ca2+的等滲溶液，混勻。的等滲溶液，混勻。 細菌原生質體細菌原生質體的再生的再生

48、：原生質體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞原生質體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內含脯氨壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內含脯氨酸和微量元素。酸和微量元素。3 3、電轉化、電轉化電轉化又稱電穿孔法電轉化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質膜是指在細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質膜上形成納米大小的微孔，上形成納米大小的微孔，DNADNA直接通過這些微孔或直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質膜進入細胞質中，這種方法稱為電穿孔法

49、。過質膜進入細胞質中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將最早用于將DNADNA導入真核細胞導入真核細胞, ,1988年年,Dower等人成等人成功應用于大腸桿菌的轉化。功應用于大腸桿菌的轉化?；驹硎抢酶邏弘娀驹硎抢酶邏弘娒}沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道可逆的瞬間通道, ,從而促進外源從而促進外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 將待轉化的質粒或將待轉化的質?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細

50、胞壁和細胞膜產生縫隙，質?；虻淖饔孟?，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內。重組分子便可進入細胞內。電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎陔姶┛邹D化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大。結構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大。電穿孔轉化法的效率受電場強度、電脈沖時電穿孔轉化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源間和外源DNA濃度等參數的影響，通過優(yōu)化濃度等參數的影響，通過優(yōu)化這些參數，每這些參數，每g DNA可以得到可以得到1091010轉轉化子。化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉化效率將電壓增高或電脈沖時間延長時，轉化效

51、率將會有所提高，但同時導致受體細胞存活率的會有所提高，但同時導致受體細胞存活率的降低，轉化效率的提高也因此被抵消。降低，轉化效率的提高也因此被抵消。用于電穿孔轉化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞用于電穿孔轉化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備容易得多當細菌生長到對數中期后予的制備容易得多當細菌生長到對數中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用低細胞懸浮液的離子強度，并用1010甘油重懸甘油重懸細胞，使其細胞濃度為細胞，使其細胞濃度為3 3l0l01010個個m1m1。分裝，。分裝，在干冰上速凍后置于在干冰上速凍后置于 -70

52、-70 貯存。這樣，每貯存。這樣，每小份細胞融解后即可用于轉化，有效期達小份細胞融解后即可用于轉化，有效期達6 6個個月以上。月以上。 電穿孔轉化須在低溫下電穿孔轉化須在低溫下(0-4)(0-4)進行，轉化效進行，轉化效率要比在室溫下操作提高約率要比在室溫下操作提高約100100倍。倍。 4 4、接合轉化：、接合轉化：接合（接合（ConjugationConjugation）：）：指通過細菌細胞之間指通過細菌細胞之間的直接接觸導致的直接接觸導致 DNA DNA 從一個細胞轉移至另一從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有

53、促進供體細胞與受體細胞有效的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導接觸的接合功能以及誘導 DNADNA分子傳遞的轉移分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼是基于非接合型質粒的遷移作用而建立的一種是基于非接合型質粒的遷移作用而建立的一種DNADNA轉化方式適用于那些難以采用轉化方式適用于那些難以采用CaCa2+2+誘導轉化誘導轉化法或電穿孔法轉化的受體菌。法或電穿孔法轉化的受體菌。 非接合型質粒分子較小，缺少編碼質粒轉移體非接合型質粒分子較小，缺少編碼質粒轉移體系所須的全部基因，不能象接合型質粒那樣在宿系所須的全部基因

54、，不能象接合型質粒那樣在宿主細胞間自我轉移。但如果宿主細胞中存在另外主細胞間自我轉移。但如果宿主細胞中存在另外一種溶合性的接合型質粒（即輔助質粒）非接合一種溶合性的接合型質粒（即輔助質粒）非接合型質粒通常也會被轉移，這種由共存的接合型質型質粒通常也會被轉移，這種由共存的接合型質粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程稱為遷移作用粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程稱為遷移作用 接合型質粒分子較大，自我轉移的隨意性強，接合型質粒分子較大，自我轉移的隨意性強，轉移過程中經常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉移過程中經常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉移，因此難以作為基因工程載體使用。目前轉移，因此難以作為基因工程載體使用。

55、目前常用的質粒載體多是在非接合型質?；蛉笔Я顺Ｓ玫馁|粒載體多是在非接合型質粒或缺失了接合轉移基因的接合型質粒的基礎上構建的，接合轉移基因的接合型質粒的基礎上構建的，故重組質粒故重組質粒DNADNA分子也不能直接接進行接合轉分子也不能直接接進行接合轉化。而只能通過其遷移作用來完成?；?。而只能通過其遷移作用來完成。首先將具有接合轉化功能的輔助質粒轉移至首先將具有接合轉化功能的輔助質粒轉移至含有重組質粒的供體細胞中，然后將這種供含有重組質粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉化作用，將重組質粒導入受體細胞。接合轉化作用，將重組質

56、粒導入受體細胞。整個接合轉化過程涉及到整個接合轉化過程涉及到3 3種有關的細菌菌株種有關的細菌菌株即待轉化的受體菌、含有要轉化的重組質粒即待轉化的受體菌、含有要轉化的重組質粒DNADNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質粒的輔的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉化法。助菌，因此稱為三親本雜交接合轉化法。5 5、重組、重組噬菌體噬菌體DNADNA分子轉導大腸桿菌分子轉導大腸桿菌 轉染：轉染：將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子直接導入受體分子直接導入受體細胞中的過程，稱為轉染。細胞中的過程，稱為轉染。 將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子導入大腸桿菌受體細分子導

57、入大腸桿菌受體細胞的常規(guī)方法是轉導操作。胞的常規(guī)方法是轉導操作。轉導轉導(transduction)(transduction)：指通過指通過噬菌體噬菌體( (病毒病毒) )顆粒感染宿主細胞的途徑把外源顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNADNA分子轉移分子轉移到受體細胞內的過程。到受體細胞內的過程。 具有感染能力的具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體顆粒除含有噬菌噬菌體體DNADNA分子外，還包括外被蛋白。分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組組噬菌體噬菌體DNADNA分子進行體外包裝分子進行體外包裝 。體外包裝，是指在體外模擬體外

58、包裝，是指在體外模擬噬菌體噬菌體DNADNA分子分子在受體細胞內發(fā)生的一系列特殊的包裝反應在受體細胞內發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組過程，將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子包裝為成熟的分子包裝為成熟的具有感染能力的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術。噬菌體顆粒的技術。 基本原理：基本原理：根據根據噬菌體噬菌體DNADNA體內包裝的途徑體內包裝的途徑分別獲得缺失分別獲得缺失D D包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株和噬菌體突變株和缺失缺失E E包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株。這兩種突噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝變株均不能單獨地包裝噬菌體噬菌體DNADNA，但將它，但將它們分別感染

59、大腸桿菌，從中提取缺失們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D D蛋白的蛋白的包裝物（含包裝物（含E E蛋白蛋白) )和缺失和缺失E E蛋白的包裝物蛋白的包裝物( (含含D D蛋白蛋白) )，兩者混合后就能包裝，兩者混合后就能包裝噬菌體噬菌體DNADNA。 噬菌體噬菌體DNADNA體外包裝的主要過程體外包裝的主要過程制備包裝物。制備包裝物。 須培養(yǎng)兩種溶原菌須培養(yǎng)兩種溶原菌 誘導溶菌生長誘導溶菌生長 收集和貯存包裝物。收集和貯存包裝物。體外包裝。體外包裝。制備制備噬菌體噬菌體DNADNA混合液。混合液。第一次包裝。包裝物剛融化時，細胞發(fā)生破裂，釋放出第一次包裝。包裝物剛融化時，細胞發(fā)生破裂，釋放出包

60、裝物可立即用于包裝。包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率2 25 5倍倍，加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應，加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應的進行。的進行。去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入SMSM溶液溶液 （噬菌體稀釋緩沖液：（噬菌體稀釋緩沖液：100 mmol/L NaCl,100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 10 mmol/L MgSOMgSO4 4, , 50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)0.2%50 mmo