儀器分析概論 11 熒光與磷光

1、1 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1. 分子能級與躍遷分子能級與躍遷 分子能級比原子能級復(fù)雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級； 基態(tài)基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2

2、；22.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或或1)； 平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖)；進(jìn)入的幾率小； 33. 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷遷(發(fā)光發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)

3、移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；4S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量21 3外轉(zhuǎn)換 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量21 3外轉(zhuǎn)換 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫5非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程 振動弛豫振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振

4、動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10 -12 s。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。系間跨越系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。6輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程 熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動能級的最低振動能級基

5、態(tài)基態(tài)（ 多為 S1 S0躍躍遷），發(fā)射波長為 2的熒光； 由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； 2 2 1 ； 磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動能級的最低振動能級基態(tài)基態(tài)（ T1 S0躍遷躍遷）； S0 激發(fā)振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫 T1 發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時間。7 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 熒光熒光(磷光磷光)：光致發(fā)光光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？，照射光波長如何選擇？1.熒光熒光(磷光磷光)的激發(fā)光譜曲線的激發(fā)光譜曲線 固定

6、測量波長固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；82.熒光光譜熒光光譜(或磷光光譜或磷光光譜) 固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。9200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜103.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a. Stokes位移位移 激發(fā)

7、光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。 b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖 2 , 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如 2 )。 c. 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。 11熒光分析法在生物上的應(yīng)用熒光分析法在生物上的應(yīng)用 12熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 利用FRET檢測分子構(gòu)象變化示意圖。13分子信標(biāo)：分子信標(biāo)：14generaliza

8、tion生物芯片：微型實驗室生物芯片：微型實驗室 生物芯片計算機(jī)芯片生物芯片：生物芯片：在可識別的有序點(diǎn)陣集合上，試樣與每個點(diǎn)陣發(fā)生分子間反應(yīng)或雜交后，通過掃描檢測同時獲得各個點(diǎn)陣上的作用信息；生物芯片DNA芯片蛋白質(zhì)芯片基因芯片15 生物芯片生物芯片 微全分析系統(tǒng)微全分析系統(tǒng)16生物芯片生物芯片試樣處理點(diǎn)陣固定反應(yīng)或雜交芯片制作標(biāo)記洗滌檢測掃描光刻合成微量點(diǎn)樣噴墨純化、標(biāo)記光化學(xué)檢測電化學(xué)檢測計算處理17芯片的反應(yīng)與雜交芯片的反應(yīng)與雜交 依據(jù)雙螺旋原理發(fā)展的核酸鏈間分子雜交技術(shù)，在靶標(biāo)樣品與探針之間進(jìn)行選擇性反應(yīng)，將反應(yīng)一方(探針)固定在芯片上，另一方(熒光標(biāo)記)通過流路或加至芯片上；影響雜

9、交反應(yīng)的因素：影響雜交反應(yīng)的因素：（1）探針濃度：其濃度差異對信號有影響；濃度高信號強(qiáng)；（2）陽離子：陽離子存在可提高異源雜交雙鏈的生成速度；（3）溫度：ONA2542C；CDA5570 C ；（4）序列組成：芯片上一次產(chǎn)生上萬個異源雜交反應(yīng)，應(yīng)選擇最協(xié)調(diào)條件。18生生物物芯芯片片合合成成程程序序19芯芯片片合合成成過過程程20芯片合成過程：芯片合成過程：21芯片信息采集：芯片信息采集：熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記雙波長掃描激光激發(fā)光源激光激發(fā)光源共聚焦掃描共聚焦掃描計算機(jī)處理計算機(jī)處理22生物芯片技術(shù)的應(yīng)用生物芯片技術(shù)的應(yīng)用2. 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 基因組計劃后的另一項重要計劃：蛋白組計劃；基因組計劃后的另一項重要計劃：蛋白組計劃； 正常與癌變細(xì)胞蛋白譜的差異分析。正常與癌變細(xì)胞蛋白譜的差異分析。3. 基因突變檢測與遺傳病和腫瘤診斷基因突變檢測與遺傳病和腫瘤診斷 大量平行測定。大量