儀器分析概論 11 熒光與磷光

1、1 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1. 分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)與躍遷 分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜； 在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)； 基態(tài)基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2

2、；22.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或或1)； 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率小； 33. 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷遷(發(fā)光發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)

3、移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；4S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量21 3外轉(zhuǎn)換 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量21 3外轉(zhuǎn)換 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫5非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程 振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振

4、動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。系間跨越系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。6輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程 熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基

5、態(tài)基態(tài)（ 多為 S1 S0躍躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為 2的熒光； 由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)； 2 2 1 ； 磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)（ T1 S0躍遷躍遷）； S0 激發(fā)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫 T1 發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。7 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 熒光熒光(磷光磷光)：光致發(fā)光光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.熒光熒光(磷光磷光)的激發(fā)光譜曲線的激發(fā)光譜曲線 固定

6、測(cè)量波長(zhǎng)固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng))，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；82.熒光光譜熒光光譜(或磷光光譜或磷光光譜) 固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。9200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜103.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a. Stokes位移位移 激發(fā)

7、光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。 b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖 2 , 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如 2 )。 c. 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。 11熒光分析法在生物上的應(yīng)用熒光分析法在生物上的應(yīng)用 12熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 利用FRET檢測(cè)分子構(gòu)象變化示意圖。13分子信標(biāo)：分子信標(biāo)：14generaliza

8、tion生物芯片：微型實(shí)驗(yàn)室生物芯片：微型實(shí)驗(yàn)室 生物芯片計(jì)算機(jī)芯片生物芯片：生物芯片：在可識(shí)別的有序點(diǎn)陣集合上，試樣與每個(gè)點(diǎn)陣發(fā)生分子間反應(yīng)或雜交后，通過掃描檢測(cè)同時(shí)獲得各個(gè)點(diǎn)陣上的作用信息；生物芯片DNA芯片蛋白質(zhì)芯片基因芯片15 生物芯片生物芯片 微全分析系統(tǒng)微全分析系統(tǒng)16生物芯片生物芯片試樣處理點(diǎn)陣固定反應(yīng)或雜交芯片制作標(biāo)記洗滌檢測(cè)掃描光刻合成微量點(diǎn)樣噴墨純化、標(biāo)記光化學(xué)檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè)計(jì)算處理17芯片的反應(yīng)與雜交芯片的反應(yīng)與雜交 依據(jù)雙螺旋原理發(fā)展的核酸鏈間分子雜交技術(shù)，在靶標(biāo)樣品與探針之間進(jìn)行選擇性反應(yīng)，將反應(yīng)一方(探針)固定在芯片上，另一方(熒光標(biāo)記)通過流路或加至芯片上；影響雜

9、交反應(yīng)的因素：影響雜交反應(yīng)的因素：（1）探針濃度：其濃度差異對(duì)信號(hào)有影響；濃度高信號(hào)強(qiáng)；（2）陽離子：陽離子存在可提高異源雜交雙鏈的生成速度；（3）溫度：ONA2542C；CDA5570 C ；（4）序列組成：芯片上一次產(chǎn)生上萬個(gè)異源雜交反應(yīng)，應(yīng)選擇最協(xié)調(diào)條件。18生生物物芯芯片片合合成成程程序序19芯芯片片合合成成過過程程20芯片合成過程：芯片合成過程：21芯片信息采集：芯片信息采集：熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記雙波長(zhǎng)掃描激光激發(fā)光源激光激發(fā)光源共聚焦掃描共聚焦掃描計(jì)算機(jī)處理計(jì)算機(jī)處理22生物芯片技術(shù)的應(yīng)用生物芯片技術(shù)的應(yīng)用2. 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 基因組計(jì)劃后的另一項(xiàng)重要計(jì)劃：蛋白組計(jì)劃；基因組計(jì)劃后的另一項(xiàng)重要計(jì)劃：蛋白組計(jì)劃； 正常與癌變細(xì)胞蛋白譜的差異分析。正常與癌變細(xì)胞蛋白譜的差異分析。3. 基因突變檢測(cè)與遺傳病和腫瘤診斷基因突變檢測(cè)與遺傳病和腫瘤診斷 大量平行測(cè)定。大量