單基因遺傳病的研究策略

1、研究策略與方法研究策略與方法v 臨床診斷、家系調查與材料收集臨床診斷、家系調查與材料收集v 侯選基因的確定侯選基因的確定v 已知致病基因突變位點的確定已知致病基因突變位點的確定v 連鎖分析與未知基因的基因定位連鎖分析與未知基因的基因定位v 基因型與表現(xiàn)型相關性研究基因型與表現(xiàn)型相關性研究v 發(fā)病機制的研究發(fā)病機制的研究臨床診斷臨床診斷 查閱相關資料，認識不同遺傳病患者臨床表現(xiàn)及其輔助診斷措施查閱相關資料，認識不同遺傳病患者臨床表現(xiàn)及其輔助診斷措施 臨床診斷：癥狀和體征臨床診斷：癥狀和體征 常規(guī)輔助檢測指標常規(guī)輔助檢測指標 特殊診斷指標特殊診斷指標家系調查與系譜分析家系調查與系譜分析 調查家系三

2、代以上所有相關成員的信息調查家系三代以上所有相關成員的信息 根據(jù)調查資料，用系譜中常用的符號繪制根據(jù)調查資料，用系譜中常用的符號繪制成系譜成系譜 系譜分析：區(qū)別遺傳病與非遺傳病系譜分析：區(qū)別遺傳病與非遺傳病 區(qū)別單基因與多基因病區(qū)別單基因與多基因病 判斷遺傳方式判斷遺傳方式大家系大家系散發(fā)病例散發(fā)病例臨床遺傳病家系特點臨床遺傳病家系特點 散發(fā)病例：對于遺傳病，包括單基因遺傳病，多數(shù)病例表現(xiàn)為散發(fā)。散發(fā)病例：對于遺傳病，包括單基因遺傳病，多數(shù)病例表現(xiàn)為散發(fā)。 小家系病例：在有家族史的病例中，多數(shù)也是小家系。小家系病例：在有家族史的病例中，多數(shù)也是小家系。 大家系病例：極少數(shù)家系發(fā)病個體多，涉及大

3、家系病例：極少數(shù)家系發(fā)病個體多，涉及3-43-4代都有患者。代都有患者。收集材料收集材料 采集樣品：采集樣品： 外周血，頰粘膜脫落細胞，毛囊, 病人組織（如可以取材）， 羊水（產(chǎn)前診斷） 采集家系應做到盡可能完整采集家系應做到盡可能完整 患者、同一家系中有相同遺傳背景的表型正常的其他個體、該家系中其他遺傳背景的成員收集臨床資料收集臨床資料 病人臨床上一系列指標的檢測 保存相關信息和影象資料 病人血清或組織的保存及其酶、病理或免疫學研究數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫v 中的OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man ）數(shù)據(jù)庫中整合了目前

4、已定位的單基因病的信息v 確定自己所研究家系的可能已知候選基因或已定位的染色體候選區(qū)域根據(jù)疾病名稱檢索根據(jù)疾病名稱檢索根據(jù)基因檢索根據(jù)基因檢索檢索最新文獻檢索最新文獻 獲得已知基因基因組序列獲得已知基因基因組序列 設計引物或參考文獻中引物設計引物或參考文獻中引物 根據(jù)文獻，采用合適的技術方法進行基根據(jù)文獻，采用合適的技術方法進行基因突變分析（在后面課程中詳細介紹）因突變分析（在后面課程中詳細介紹）從數(shù)據(jù)庫中查閱目的基因從數(shù)據(jù)庫中查閱目的基因的相關信息的相關信息 PCR-測序分析測序分析MFN2基基因因結果發(fā)現(xiàn)錯義突變: c.281 GA,其所在密碼子由CGG變?yōu)镃AG, 導致其編碼氨基酸由精氨

5、酸變?yōu)楣劝滨０? 結論：經(jīng)查閱文獻資料， c.281 GA為已知致病突變位點，可判斷其為該患者的致病突變位點。 根據(jù)變異導致的結果判斷根據(jù)變異導致的結果判斷 根據(jù)突變數(shù)據(jù)庫和文獻資料根據(jù)突變數(shù)據(jù)庫和文獻資料 排除已知排除已知SNPSNP 根據(jù)家系共分離與否判斷根據(jù)家系共分離與否判斷 在正常對照人群中分析在正常對照人群中分析 保守性分析保守性分析 基因功能分析基因功能分析突變分析結果的判斷突變分析結果的判斷注：適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例 連鎖連鎖 重組重組遺傳標記遺傳標記基因克隆基因克隆：確定致病基因基因例：一個例：一個X連鎖肌肉病家系致病基因連鎖肌肉病家系致病基因的定

6、位克隆研究的定位克隆研究 家系情況及前期研究基礎家系情況及前期研究基礎 先證者2臨床表現(xiàn)近似DMD 排除了DMD/EMD/FHL1基因突變研究策略研究策略SNPSNP芯片分芯片分析析精細定位精細定位分析分析基因查閱基因查閱外顯子組外顯子組測序測序全基因組90萬個SNP位點；8例樣本；商業(yè)公司完成選取數(shù)個SNP點；增加3個成員連鎖區(qū)域內的基 因 ： M a p Viewer；基 因 表 達 ：UniGene數(shù)據(jù)庫及HGNC網(wǎng)站；基 因 功 能 ：OMIM數(shù)據(jù)庫1例樣本(I2)；商業(yè)公司完成SNP芯片數(shù)據(jù)分析 連鎖分析 提示X染色體有三段連鎖區(qū)域：單體型分析 Gene map locusGRCh3

7、7.p5 Primary Assembly (STS)P h y s i c a l distance (Mb)Genetic Distance(cM)Genetic Map(Marshfield)(cM) Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49 Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62 Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段連鎖區(qū)域精細定位分析將Xp22.32-p22.2Xp22.32-p2

8、2.2連鎖區(qū)域由6.78Mb 6.78Mb 縮短為4.18Mb4.18Mb 排除Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1連鎖區(qū)域肯定Xq24-q27.2Xq24-q27.2連鎖區(qū)域最終確定兩段連鎖區(qū)域Gene map locusGRCh37.p5 Primary Assembly (STS)Physical distance(Mb)G e n e t i c Distance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52 Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9

9、515.2670.80-86.06 連鎖區(qū)域內包含的基因Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2連鎖區(qū)域共28個基因：14個已知基因,14個預測基因14個已知基因： 6個基因在肌肉組織中表達 （3個基因表型已知，均與肌肉病無關） 7個基因不在肌肉組織表達 1個基因表達情況未知 Xq24-q27.2Xq24-q27.2連鎖區(qū)域共272個基因：122個已知基因,150個未知基因122個已知基因： 79個基因在肌肉組織中表達 （18個基因表型已知，其中包括前期已經(jīng)排除的FHL1基因） 41個基因不在肌肉組織表達 2個基因表達情況不清楚外顯子組測序平均覆蓋度：23.8 ；覆蓋度大于20位點

10、占53.7%在上述兩個連鎖區(qū)域測序深度均很低對測序深度20的變異位點進行驗證，結果均無變異存在的問題及解決辦法本家系患者未進行肌肉活檢將進行多個樣本的外顯子組測序Genotype和和Phenotype相關性研究相關性研究例：非綜合征型先天缺牙的分子例：非綜合征型先天缺牙的分子遺傳學研究遺傳學研究 J Dent Res, 2009; 88:126-131 Eur J Med Genet, 2008; 51: 536-546 Eur J Med Genet, 2011; 54: 377-382單基因遺傳病發(fā)病機制的單基因遺傳病發(fā)病機制的研究研究 隱性突變隱性突變往往導致失去功能（loss of f

11、unction） 顯性突變可導致獲得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：單倍劑量不足（halpoinsufficency） 獲得功能：顯性負效應（dominant negtive） Gain of function ： Loricrin基因突變獲得核轉位的新功能基因突變獲得核轉位的新功能 Br J Dermatol, 2008; 159:714-719 Loricrin 角皮病角皮病連鎖分析與連鎖分析與1q21區(qū)域連鎖區(qū)域連鎖發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Loricrin基因新突變基因新突變特殊的臨床表現(xiàn)特殊的臨床表現(xiàn)突變蛋白序列新功能的預測突變蛋白序列新功能的預測GFP表達載體的構建表達

12、載體的構建細細胞胞亞亞定定位位分分析析動物模型動物模型 過表達和基因敲除小鼠模型均表現(xiàn)正常表型 轉基因小鼠表現(xiàn)出與人類疾病相似的疾病表型，提示突變基因獲得功能為其發(fā)病機制?；蚯贸∈蟊硇突菊；蚯贸∈蟊硇突菊＾D基因小鼠表型與人類疾病相似轉基因小鼠表型與人類疾病相似結結 論論 Haploinsufficiency ： PAX6基因單倍劑量不足影響胰島素基因單倍劑量不足影響胰島素成熟過程導致糖耐受異常成熟過程導致糖耐受異常 Diabetologia. 2009; 52:504-13先天性無虹膜家系先天性無虹膜家系在該家系發(fā)現(xiàn)在該家系發(fā)現(xiàn) PAX6 突變突變(c.1080CT)導致單倍劑

13、量不足導致單倍劑量不足 SSCP analysis DNA sequencing PAX6 基因及其基因及其 cDNAPAX6的功能的功能Hill et al. Nature 354, 1991;St-Onge et al. Nature 387, 1997; Sander et al. Genes Dev 11,1997PAX6 在胰腺發(fā)育中的功能在胰腺發(fā)育中的功能Mansouri et al. TEM 10, 1999Dohrmann et al. Mech Dev 92, 2000 PAX6 在成體胰腺中的功能在成體胰腺中的功能假假 說說 PAX6 mutation?abnormal g

14、lucose homeostasisOGTT Analysis in the Aniridia Pedigree 血糖和胰島素水血糖和胰島素水平平總結總結 1Aniridia caused by PAX6 gene mutation PAX6 mutation caused impaired glucose tolerance (IGT)PAX6-related IGT was associated with age 問問 題題Does IGT come from deficiency of insulin?Do these patients have insulin resistance?D

15、o patients have a defect in insulin processing? PAX6 Had No Effect on the Transcriptional Activity of the Insulin Promoter胰島素耐受沒有異常胰島素耐受沒有異常胰島素原顯著高胰島素原顯著高總結總結 2PAX6 had no effect on the insulin transcription IGT was not result from insulin resistanceIGT may come from a defect in insulin processingPC1 的功能的功能Proinsulin insulinin Pancreas POMC ACTHalpha-MSHin Hypothalamus Marcinkiewicz et al. Proc Natl Acad Sci 90, 1993 Naggert et al. Nature Genetics 10, 1995ACTH和和Alpha-MSH水平水平總結總結3 Deficiency of PC1 caused by PAX6 mutation was indicated假假 說說 PAX6 mutation?PC1deficiencyabnormal glucose home