基因克隆程一

1、基 因 克 隆 第一章 緒論 第二章 基因工程的工具酶 第三章 基因工程載體 第四章 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 第五章 目的基因的表達(dá) 第六章 基因文庫技術(shù) 第七章 目的基因的分離技術(shù)參考書 現(xiàn)代分子生物學(xué)與基因工程，李海英，化學(xué)工業(yè)出版社 基因工程原理，吳乃虎，科學(xué)出版社 基因工程，樓士林，科學(xué)出版社（21世紀(jì)高等教材）第一章 緒 論一、基因工程的概念（genetic engineering)1、基因操作、遺傳工程、重組體DNA技術(shù)2、嵌合DNA、DNA嵌合體（DNA chimera)3、分子克隆（molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) 重組DNA (re

2、combinant DNA)4、基因工程的操作步驟1、基因克隆的操作步驟： 1）從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。 2）在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。 3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞、宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。 4）從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。 5）從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。 2、基因表達(dá)的操作步驟：1）從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化

3、或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2）將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、基因工程發(fā)展簡史 1972年，Stanford University（ivy-covered campus)， Berg，第一個體外重組的人工DNA分子（EcoR ，SV40DNA，DNA） 1973年，Cohen，完成了DNADNA分子體外重組和擴(kuò)增的全過程，基因工程誕生之年，是基因工程的創(chuàng)始人 Stanvard University Stanvard University 三、基因工程的巨大意義（一）利用微生物制藥 1、利用微生物生

4、產(chǎn)胰島素 2、重組微生物生產(chǎn)生長激素 3、重組微生物生產(chǎn)干擾素利用微生物生產(chǎn)胰島素 世界上有6000萬糖尿病患者（胰臟產(chǎn)生的胰島素不足），400萬定期注射胰島素 在美國，每年人口增長率1%，糖尿病患者增長率5%-6%。 每位患者每年需要3-5kg的胰臟組織，40頭?；?0頭豬 1978年，2000L大腸桿菌培養(yǎng)液獲得了100g 胰島素，相當(dāng)于從1t豬胰臟中提取的產(chǎn)量。 1980年，英國倫敦17位志愿者接受了基因工程胰島素的注射。 1986年，基因工程生產(chǎn)的胰島素正式進(jìn)入市場重組微生物生產(chǎn)生長激素 侏儒癥 每個患者每年需要80個尸體的腦垂體，1%的病人能夠接受治療。 1979年，利用基因工程生產(chǎn)

5、人生長激素 1987年，產(chǎn)品進(jìn)入市場 1998年，美國有3000名兒童接受了治療 從腦垂體細(xì)胞中分離人生長激素的 mRNA 通過逆轉(zhuǎn)錄酶 合成 cDNA（由于生長激素基因前面有一段信號肽的DNA大腸桿菌不能識別，不能產(chǎn)生正確的有活性的生長激素） 用內(nèi)切酶切去這個基因上的信號肽DNA序列 化學(xué)方法合成一段DNA 合成的基因插入到質(zhì)粒中 導(dǎo)入大腸桿菌生產(chǎn)人生長激素。重組微生物生產(chǎn)干擾素 1957年，被確定具有抗病毒的特性，分為三類 1980年，破譯了干擾素的全部遺傳密碼，利用大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，可以治療肝炎和抑制腫瘤。（二）克（二）克 隆隆 技技 術(shù)術(shù) ( (clone technology)clo

6、ne technology)克隆的概念 克隆是英文 “clone”的音譯，源于希臘文“klon”，原意是指植物幼苗或嫩枝以無性繁殖或營養(yǎng)繁殖的方式培育，也就是指用除種子之外的植物體的任何一部分進(jìn)行無性繁殖。 凡是沒有精卵結(jié)合過程，而由同一個祖先細(xì)胞獲得的兩個以上的細(xì)胞、細(xì)胞群或生物體，或是由同一個親本DNA序列產(chǎn)生子代DNA 的方式就是克隆，用這種方式分化發(fā)育得到的生物體與母體的基因是完全相同的。 克隆是指生物體通過體細(xì)胞進(jìn)行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。 A羊 B羊 從雌性成年綿羊 從B羊取出卵子用電擊 乳腺組織抽取細(xì)胞 法將細(xì)胞核除去 殖入載有A綿羊

7、遺傳信息的細(xì)胞核 卵子 C綿羊 遺傳特性上完全 與A相同的小綿羊 “多莉” 多莉與邦尼器官移植 1954年，腎臟移植，通過器官移植存活的患者有40萬 1969年，黑猩猩的肝臟移植進(jìn)入人的體內(nèi) 1992年，狒狒的肝臟移植，骨髓移植 受到野生動物保護(hù)委員會的指責(zé)對豬的器官進(jìn)行了基因改造，培養(yǎng)出帶有人類基因的豬干細(xì)胞研究及人類倫理觀念干細(xì)胞研究及人類倫理觀念 干細(xì)胞（stem cell）是指尚未分化的細(xì)胞，存在于早期胚胎、骨髓、臍帶、胎盤和部分成年人細(xì)胞中，具有較強(qiáng)的再生能力，在干細(xì)胞因子和多種白細(xì)胞介素的聯(lián)合作用下，可被培育成肌肉、骨骼和神經(jīng)等人體組織和器官。 胚胎干細(xì)胞（embryo stem

8、cell.ES）是在人胚胎發(fā)育早期囊胚（受精后約57天）中未分化的細(xì)胞。 外表是一層扁平細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱內(nèi)細(xì)胞群， 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等?！叭说纳螘r開始？”“成為人意味著什么？”“什么是胚胎，它在什么時候變成人？” 支持者認(rèn)為干細(xì)胞的研究有利治療人類的疾病，造福于人類； 反對者則稱這一決定將造成濫用人類胚胎、造成人類研究資源的枯竭，扼殺人類的生命；還有的則認(rèn)為應(yīng)當(dāng)將是否允許進(jìn)行干細(xì)胞研究交給法庭決斷。（三） 基因工程育種1、基因改造的農(nóng)作物

9、2、轉(zhuǎn)基因動物基因改造的農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因植物的概念： 在一個植物細(xì)胞中采用微注射法、基因槍法以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入新的基因，再分化成為遺傳改變的個體，就能獲得我們想要的新品種，也就是轉(zhuǎn)基因植物。 轉(zhuǎn)基因抗蟲作物 轉(zhuǎn)基因抗病毒作物 轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物 抗不良環(huán)境和抗衰老的轉(zhuǎn)基因作物 改善農(nóng)作物的品質(zhì)轉(zhuǎn)基因抗蟲作物轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的優(yōu)點(diǎn)：DDT滴滴涕：二氯二苯三氯乙烷 1、成本較低，持續(xù)抗性 2、保護(hù)作用遍及全株 3、安全、可靠 4、具有高度特異性 轉(zhuǎn)原毒素基因Bt的棉花轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物抗早熟的轉(zhuǎn)基因番茄 多聚半乳糖醛酸酶（） 可以消化番茄細(xì)胞壁的果膠，引起番茄成熟、腐爛。將編碼此酶基因的反義基

10、因轉(zhuǎn)入植物中，反義mRNA與正義mRNA分子結(jié)合，PG不能產(chǎn)生，延遲果實的成熟過程?？箖龅霓D(zhuǎn)基因大豆提高淀粉含量的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯2、轉(zhuǎn)基因動物步驟：1、將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細(xì)胞核中；2、接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；3、移植后的受精卵發(fā)育生長為后代；4、利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系。轉(zhuǎn)基因動物四、基因工程的安全性問題逃逸GMO的安全性GMO的安全性 GMO： Genetic Modification Organism 1、轉(zhuǎn)基因食品有毒性嗎？美國食品和藥物管理局：一般食品1218個月，GMO要6年(U.S. Food and

11、 Drug Administration,FDA) 2、轉(zhuǎn)基因食品會造成過敏嗎？巴西堅果的貯存蛋白2 S清蛋白（蛋氨酸含量高） 3、轉(zhuǎn)基因作物中標(biāo)記基因會不會有危險？大部分DNA已降解， 只剩下0.1%的DNA重組微生物生產(chǎn)生長激素 侏儒癥 每個患者每年需要80個尸體的腦垂體，1%的病人能夠接受治療。 1979年，利用基因工程生產(chǎn)人生長激素 1987年，產(chǎn)品進(jìn)入市場 1998年，美國有3000名兒童接受了治療（二）克（二）克 隆隆 技技 術(shù)術(shù) ( (clone technology)clone technology)（二）克（二）克 隆隆 技技 術(shù)術(shù) ( (clone technology)clone technology)器官移植 1954年，腎臟移植，通過器官移植存活的患者有40萬 1969年，黑猩猩的肝臟移植進(jìn)入人的體內(nèi) 1992年，狒狒的肝臟移植，骨髓移植 受到野生動物保護(hù)委員會的指責(zé)對豬的器官進(jìn)行了基因改造，培養(yǎng)出帶有人類基因的豬器官移植 1954年，腎臟移植，通過器官移植存活的患