mianyizhuodu解讀

1、免疫濁度分析技術(shù)免疫濁度分析技術(shù) 信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與檢驗(yàn)系藥學(xué)與檢驗(yàn)系 ?20世紀(jì)70年代建立。它是將液相內(nèi)的沉淀試驗(yàn)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù)。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合，在二者比例合適、并有一定濃度的電解質(zhì)存在時(shí)，可以形成不溶性的免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用肉眼或儀器測(cè)知，并可通過(guò)濁度推算出復(fù)合物的量，即抗原或抗體的量。 免疫濁度測(cè)定是定量測(cè)定微量抗原物質(zhì)一種高靈敏度、快速的自動(dòng)化免疫分析技術(shù) ,其應(yīng)用廣泛。 ? 免疫濁度分析方法類型免疫濁度分析方法類型 ?一、透射免疫比濁法 二、速率抑制免疫比濁法 三、散射免疫比濁法 四、免

2、疫膠乳濁度測(cè)定法 一、透射免疫濁度測(cè)定法一、透射免疫濁度測(cè)定法 原理：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液過(guò)量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出受檢物質(zhì)的含量。 技術(shù)要點(diǎn)： 1）抗原參考品及待測(cè)標(biāo)本作適當(dāng)稀釋； 2）將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原液（5個(gè)濃度）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處檢測(cè)各管吸光度；（ 3）以劑量-反應(yīng)曲線求得標(biāo)本中抗原的濃度。 方法評(píng)價(jià)： ?本法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，能用全自動(dòng)化或半自動(dòng)化儀器進(jìn)行分析。 ?靈敏度低于散射比濁法，但比單擴(kuò)散法高5-

3、10倍。 ?抗體用量較大，檢測(cè)需抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，耗時(shí)較長(zhǎng)。 ?不宜用于藥物半抗原的檢測(cè)。 二、散射免疫比濁法 ?1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的抗原抗體復(fù)合物微粒上時(shí)，部分光線發(fā)生散射的原理，通過(guò)測(cè)量散射光的強(qiáng)度來(lái)得知待測(cè)抗原的量，這種比濁測(cè)定法稱為散射比濁法 1977年Sternberg進(jìn)一步發(fā)展建立了速率散射比濁法使微量抗原的定量測(cè)定得以快速靈敏地進(jìn)行。 基本原理基本原理 ?散射比濁法是指沿水平軸照射的一定波長(zhǎng)的光，通過(guò)溶液時(shí)光線被免疫復(fù)合物粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。反應(yīng)溶液中的懸浮分子，無(wú)論是固體或膠體粒子都可以是散射中心。當(dāng)入射光通過(guò)時(shí)，如果顆粒直徑比入

4、射光的波長(zhǎng)小很多（入射光波長(zhǎng)的1/101/20），則散射光在各個(gè)方向上的分布比較均勻，稱為Rayleigh散射；粒徑與入射光的比例增大，正向散射光強(qiáng)度趨于增強(qiáng)，當(dāng)粒徑略小于入射光波長(zhǎng)時(shí)，稱為Debye散射；如果顆粒直徑接近或大于入射光波長(zhǎng)時(shí)，則散射光呈明顯的不均勻分布，稱為Mile散射。 入射光波長(zhǎng)越小，散射光越強(qiáng)； ?散射光強(qiáng)度與粒子的濃度和體積成正比； ?散射光強(qiáng)度隨焦點(diǎn)至檢測(cè)器距離的平方和而下降。 因此，在散射比濁中，增加抗原抗體復(fù)合物的體積，減少入射光的波長(zhǎng)，將檢測(cè)點(diǎn)盡可能地接近散射源并選擇合適的檢測(cè)夾角，都可使檢測(cè)的靈敏度增加。由于散射比濁法測(cè)定的是散射光的信號(hào)，避免了透射光中所含有

5、的透射、散射甚至折射等雜信號(hào)成分的影響，因此，散射比濁法的靈敏性和特異性均好于透射比濁法。 ?散射比濁法類型散射比濁法類型 ?終點(diǎn)散射比濁法 速率散射比濁法 （一）終點(diǎn)散射比濁法（一）終點(diǎn)散射比濁法 ?抗原、抗體相遇后免疫沉淀反應(yīng)立即開始，但反應(yīng)達(dá)到平衡通常需 1030min。免疫濁度測(cè)定應(yīng)在復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)行，否則光散射值降低，影響測(cè)定結(jié)果。因此，終點(diǎn)散射比濁通常是在免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間時(shí)測(cè)量其濁度，故亦可稱為定時(shí)散射比濁 （二）速率散射比濁法（二）速率散射比濁法 ?速率散射比濁法是一種先進(jìn)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，1977年由Sternberg首先用于免疫學(xué)測(cè)定。 所謂速率是指單位時(shí)間

6、內(nèi)抗原與抗體反應(yīng)的速度。 抗原與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的速度，在每個(gè)單位時(shí)間內(nèi)是不相同的，在抗體過(guò)量的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的總量逐漸增加，通常在 25s時(shí)出現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)最快的速率峰。峰值與抗原量呈正相關(guān)。 抗原抗體反應(yīng)的速率變化抗原抗體反應(yīng)的速率變化 散 射 光 強(qiáng) 度 到達(dá)峰值時(shí)間 time 三、速率抑制免疫比濁法 ?本法是一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)，主要用于測(cè)定半抗原和藥物等小分子物質(zhì)。試劑中的特異性抗體是由半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后，免疫動(dòng)物制備而成。 試驗(yàn)時(shí)先將一定量的已知半抗原 - 載體（大分子）與限量的特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，生成的免疫復(fù)合物可形成一定的速率散射峰值。

7、?當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)加入待檢標(biāo)本時(shí)，其中所含的半抗原（小分子）與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使大分子的半抗原 - 載體- 抗體復(fù)合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度與標(biāo)本中的待測(cè)半抗原（或藥物）成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)的含量。 四、免疫膠乳濁度測(cè)定法四、免疫膠乳濁度測(cè)定法 原理： 將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，則使乳膠顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)不阻礙光線透過(guò)，兩個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)，則使透過(guò)光減少，這種減少的程度與膠乳凝集的程度呈正比，當(dāng)然也與待測(cè)抗原量呈正比。 ?五、免疫濁度分析的影響因素五、免疫濁度分析的影響因素 抗原抗體反

8、應(yīng)的比例 ? 抗體試劑的質(zhì)量 ? 抗原抗體反應(yīng)的溶液 ? 增濁劑的作用 ?（一）抗原抗體反應(yīng)的比例（一）抗原抗體反應(yīng)的比例 ?濁度法中的免疫反應(yīng)遵循抗原抗體反應(yīng)的一般規(guī)律。免疫濁度測(cè)定的反應(yīng)體系中必須始終保持抗體過(guò)量，以保證免疫復(fù)合物的生成量與濁度的改變一致，這是免疫濁度測(cè)定的基本原則。 抗體過(guò)剩必須適量，因此實(shí)驗(yàn)中掌握抗體的濃度是個(gè)關(guān)鍵。 為了減少非特異性濁度（為了減少非特異性濁度（“偽濁度偽濁度”）的出現(xiàn)，）的出現(xiàn)，還應(yīng)對(duì)抗原（待測(cè)樣品）進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅?（二）抗體試劑的質(zhì)量（二）抗體試劑的質(zhì)量 ?1抗體的質(zhì)量：免疫比濁測(cè)定法要求抗體的特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)。 2 抗體的類型 ：根據(jù)抗

9、血清來(lái)源的動(dòng)物種類不同，抗體可分為R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗體是用于免疫比濁測(cè)定的較為理想的試劑。 （三）抗原抗體反應(yīng)的溶液（三）抗原抗體反應(yīng)的溶液 ?反應(yīng)液對(duì)免疫復(fù)合物的形成也起重要作用?？乖贵w反應(yīng)液的最適pH值為6.58.5，超過(guò)此限度則不易形成復(fù)合物，甚至可引起復(fù)合物解離。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，復(fù)合物形成快；離子強(qiáng)度過(guò)低或無(wú)電解質(zhì)存在，則不易出現(xiàn)可見的沉淀反應(yīng)。離子的種類也可影響免疫復(fù)合物的形成，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫濁度法的反應(yīng)液。 （四）增濁劑的作用（四）增濁劑的作用 ?在反應(yīng)體系中加入某些非離子型親水劑，如聚乙二醇（poly

10、ethylene glycol,PEG）、吐溫-20（tween-20）等，可以促進(jìn)抗原抗體復(fù)合物的形成，增加反應(yīng)濁度。 以PEG6000為最常用。 全自動(dòng)的免疫濁度測(cè)定儀特點(diǎn)全自動(dòng)的免疫濁度測(cè)定儀特點(diǎn) ?速率散射或透射比濁； 抗原過(guò)剩檢測(cè)； 自動(dòng)控制系統(tǒng)，包括自動(dòng)稀釋加液和標(biāo)本、試劑液面感應(yīng)裝置、試劑冷藏和反應(yīng)控溫系統(tǒng)； 自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能對(duì)試劑、樣品和儀器狀態(tài)自動(dòng)監(jiān)測(cè)并及時(shí)報(bào)警； 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，包括數(shù)據(jù)的計(jì)算、患者和測(cè)試資料的儲(chǔ)存、實(shí)時(shí)質(zhì)控等功能； 校準(zhǔn)和定標(biāo)程序。 六、免疫濁度測(cè)定法的應(yīng)用 ?免疫濁度法早期主要用于血清、尿和腦脊液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 近年來(lái)，隨著免疫濁度測(cè)定儀性能的不斷完善，免疫濁度法的檢測(cè)范圍不斷擴(kuò)大。 六、免疫濁度測(cè)定法的