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文檔簡介
1、2腫瘤標(biāo)志物定義:觀念上腫瘤標(biāo)志物是從病人血液,尿液或其他樣本中找到的某一腫瘤 的生化分析物。例如,肝癌的癌胚抗原。另外,它們的相關(guān)性將通過 腫瘤標(biāo)志物定量,在特定標(biāo)準(zhǔn)值以上來說明腫瘤的存在。 最后,腫瘤 標(biāo)志物的數(shù)量會(huì)提示有多少種腫瘤存在或腫瘤的發(fā)展處于哪個(gè)階段, 并不是所有的標(biāo)志物都滿足定義的標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤標(biāo)志物的臨床限制:不幸的是,大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物對(duì)某個(gè)已知腫瘤既沒有特異性也 不能通過定量來判斷它們的大小。大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物都存在這樣的限 制性。每種腫瘤的特異性和敏感性能夠作為腫瘤的篩選或其定量的指 標(biāo),需長期評(píng)估直至腫瘤標(biāo)志物的臨床和分析的結(jié)果出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。當(dāng)病人被懷疑患有癌癥時(shí),
2、醫(yī)生會(huì)要求做腫瘤標(biāo)志物的定量,在 大多數(shù)病人中,癌胚抗原有一個(gè)正常范圍,大約0-10ug/L,但它不是 一個(gè)很好的篩選指標(biāo),因?yàn)樵谄渌闆r下,如抽煙,酒精性肝硬化, 腸炎或慢性肺部疾病時(shí),它也可能高于 10ug/L。因此,盡管15ug/L 高于那些不抽煙的正常人的參考區(qū)間,但這樣的值反應(yīng)的是病人潛在 的慢性肝病,腸部疾病或肺部疾病,而不是腫瘤的存在。這種限制性 使得癌胚抗原不能通過定量來篩選胃腸道腫瘤。 一個(gè)確診的腫瘤患者 的癌胚抗原的顯著升高能被臨床檢測(cè)出來。如果腫瘤因治療而好轉(zhuǎn), 癌胚抗原水平通常會(huì)下降,如果升高這就是試驗(yàn)性的證據(jù),說明腫瘤 持續(xù)惡化,而病人會(huì)被認(rèn)為預(yù)后不良。腫瘤標(biāo)志物的實(shí)
3、驗(yàn)室檢測(cè):盡管腫瘤標(biāo)志物可能被定性的檢出它們是否存在, 但它們更多地進(jìn)行 定量檢測(cè)和與正常參考值做對(duì)比來考慮是否升高。生化技術(shù)用于檢測(cè) 這些分析物的變化,這些技術(shù)包括從傳統(tǒng)的酶學(xué)檢驗(yàn),免疫分析到細(xì) 胞遺傳學(xué)技術(shù)。標(biāo)志物的生化種類和濃度范圍通常決定檢測(cè)的方法與 要求,現(xiàn)在免疫學(xué)方法是盛行的定量檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法。從歷史上看,放免技術(shù)是第一種普遍用于檢測(cè)這些分析物的方法。這種方法用放射活性作為一種性能來定量抗原抗體反應(yīng)。最近,通過商業(yè)化的發(fā)展使得各種方法避免了放免技術(shù)所存在的弊端。例如,檢測(cè)放射性 物質(zhì),文獻(xiàn)的要求和試劑盒短的有效期。新的方法是利用分光光度酶 率檢測(cè),熒光物質(zhì),極化熒光素,時(shí)間分
4、辨熒光和化學(xué)發(fā)光去定量抗原 抗體。以下是這個(gè)章節(jié)中大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物的定量方法。3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)PCR技術(shù)是研究得最深入,運(yùn)用得最廣泛的靶技術(shù),X公司的科學(xué)家在1985年第一次介紹了什么是PCR,之后PCR發(fā)展成為了分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)主要的技術(shù),這個(gè)方法是利用寡核甘酸指導(dǎo)DNA合成的重復(fù)循環(huán),來實(shí)現(xiàn)目的序列的體外復(fù)制。寡核甘酸的序列是由 目的基因來決定的,這些寡核甘酸是在具有兩條不同鏈的靶序列的互 補(bǔ)位點(diǎn)上開始合成的。它們之間大約相隔 150-3000個(gè)堿基對(duì)。PCR的每個(gè)循環(huán)包括3個(gè)步驟:1變性,在緩沖體系中,靶基因在高 溫下孵化以致于靶鏈解離。同時(shí)加入特定的寡核甘酸引物。 2退
5、火,在這個(gè)混合反應(yīng)體系中,需降溫才能使互補(bǔ)的靶序列間發(fā)生退火結(jié)合。3延伸,延伸階段通常需在溫和的溫度下進(jìn)行。引物在 DNA聚 合酶的作用下,于DNA模板上延伸。每一次循環(huán)靶序列在理論上會(huì) 增加一倍(但實(shí)際上最后的幾次循環(huán)沒有這么高的效率)。重復(fù)了多 次以后(約20-60次),靶序列可擴(kuò)增100萬倍,特定的靶序列擴(kuò)增 產(chǎn)物能通過它特定的長度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)來識(shí)別。 而非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物很 少具有與特定靶序列產(chǎn)物一樣的大小,并且這些非特異性產(chǎn)物也不含 有與特定靶序列的雜交結(jié)構(gòu)。在傳統(tǒng)的雜交方面,由不完整的堿基組成的引物,可通過非特異性的 方法進(jìn)行退火反應(yīng),他能夠結(jié)合在靶基因的多個(gè)位點(diǎn)上,或者純化基 因組D
6、NA,因此,對(duì)于低豐度的靶基因,非特異性結(jié)合的背景,或 許比特異性的還要敏感。然而 PCR反應(yīng),需要通過兩個(gè)特異性引物 反應(yīng)來解決這個(gè)問題。這兩個(gè)引物,在對(duì)應(yīng)鏈的相對(duì)方向的退火位點(diǎn) 上開始合成。為了能更有效地進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),要求第二個(gè)引物的 退火位點(diǎn)能與第一個(gè)退火位點(diǎn)有一個(gè)適當(dāng)?shù)木嚯x。 產(chǎn)物的等倍性增加 依賴于新引物位點(diǎn)上引物的直接合成。通過這種設(shè)計(jì)能夠更好地提高 PCR的敏感性和特異性。最近技術(shù)的更新不僅簡化了 PCR的操作步驟,同時(shí)也提高了它的效 率。首先,使用的taq聚合酶是從70-75.C溫泉里生長的嗜溫菌和嗜 熱水生菌體內(nèi)分離出來的。這些taq聚合酶的半衰期在95.C是40分 鐘,
7、因此它能耐受PCR中的重復(fù)加熱和冷卻。這樣,它可以不用重 復(fù)加入新的酶來補(bǔ)充在先前步驟中失活的酶,taq聚合酶在反應(yīng)開始時(shí)就加入進(jìn)去,這樣能有效地簡化操作步驟。止匕外,通過這種方式也 能顯著地減少在退火和延伸階段因?yàn)楦邷囟鸬姆翘禺愋詳U(kuò)增。()第二個(gè)新方法是程序化加熱器的發(fā)展,熱循環(huán)器其實(shí)是一種可編程的 加熱器,它能夠在沒有人看管的情況下實(shí)現(xiàn)連續(xù)的加熱和冷卻循環(huán), 并且能消除水浴鍋與加熱器的反應(yīng)管之間的轉(zhuǎn)換這種令人厭煩的工 作。熱循環(huán)器現(xiàn)已被許多廠家生產(chǎn)和它已成為了實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)配置儀 器。5高脂血癥血中主要的酯質(zhì)是甘油三酯和膽固醇,前者是一種重要的能量來源, 后者是細(xì)胞膜和細(xì)胞器的組成成分。膽
8、固醇和甘油三酯是脂溶性的, 他們?cè)谘寒?dāng)中以脂蛋白形式運(yùn)輸,酯質(zhì)和特定的蛋白結(jié)合成眾所周 知的載脂蛋白。脂蛋白主要分成四種,1乳糜微粒,把腸內(nèi)外源性酯 質(zhì)(主要是甘油三酯)運(yùn)輸?shù)酵庵芙M織。2極低密度脂蛋白,它運(yùn)輸 內(nèi)源性甘油三酯,從肝組織到其他組織。3低密度脂蛋白,它主要是 把肝內(nèi)的甘油三酯運(yùn)輸?shù)酵庵芙M織。4高密度脂蛋白,它參與內(nèi)向轉(zhuǎn) 運(yùn)膽固醇,從外周組織到肝,以致于膽固醇能夠通過這種途徑被排泄。 這些顆粒處于一種活躍的狀態(tài),酯質(zhì)和蛋白之間很大一部分能夠相互 轉(zhuǎn)換。1、 革蘭染色革蘭染色是細(xì)菌學(xué)上使用最廣泛的著色方法,同時(shí)大部分生物體是 根據(jù)對(duì)它的反應(yīng)來分類的。革蘭氏陽性的生物體必須擁有完整的
9、細(xì)胞壁, 相似的生物體會(huì)因任何的方法損害了細(xì)胞壁而呈革蘭氏陰性,這表明了細(xì)胞壁保留的染料 的重要性,染色的原理如下。堿性染料擴(kuò)散到生物體后與碘形成不溶于水的色淀, 革蘭氏陽性生 物體的媒染細(xì)胞壁經(jīng)酒精脫色或丙酮脫水形成一個(gè)染料色淀不能通 過的屏障,在革蘭氏陰性細(xì)胞中,細(xì)胞壁上的脂類(按比例多于革蘭 氏陽性細(xì)胞)可能被溶解,從而允許結(jié)晶紫-碘復(fù)合物漏出。對(duì)這個(gè) 學(xué)說雖然有很多的反對(duì)者,但細(xì)胞壁的重要性是不可否認(rèn)的。過程:1、 準(zhǔn)備和固定已標(biāo)記的標(biāo)本2、 用結(jié)晶紫染色一分鐘,然后用碘洗去3、 添加更多碘媒染1min4、 用酒精脫色直到流出的酒精不再出現(xiàn)藍(lán)色為止5、 用水沖洗6、 在稀釋石炭酸復(fù)紅中復(fù)染1min7、 用清水沖洗并干燥很多實(shí)驗(yàn)室使用替代方法來區(qū)分或復(fù)染色,其中有一些是:丙酮:丙酮或一份丙酮和2份乙醇是比70%的乙醇更快速的脫色劑,快速 脫色不利于檢測(cè)細(xì)菌量少的標(biāo)本,也不利于無經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員使用。 中性紅色:中性紅色(中性紅色1g, 1%乙酸2ml和蒸儲(chǔ)水1000ml)可能被用 作復(fù)染色。對(duì)于染色細(xì)胞內(nèi)的生物體,它是有用的,而且
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