IPTG誘導(dǎo)對蛋白表達的影響

1、第2期鄒運明3： IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-第37卷第2期2006年4片東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報Journal of Northeast Agricultural University37(2): 199-201April 2006第2期鄒運明3： IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-文章編號 1005-9369 (2006)02-0199-03IKFG誘導(dǎo)濃度對重組李氏溶血素表達的影響鄒運明，馬武龍，高慎陽，任艷紅，李一經(jīng)（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院.黑龍江 哈爾濱I5OO3O）摘 要：單垓增生性李it（Lmonocytogenes）的主要奉力懇因h沙紙合表達

2、栽體pGEX-6P-l 4a連，轉(zhuǎn) 化大腸桿葡BI.-24在搖床條件下，利用異丙懇硫代-半乳糖積IPTG）為講導(dǎo)劑，分析比校不同PTG濃度對 衷達產(chǎn)物的影響，以確定最佳的IPTG濃度,結(jié)果表明，在裝有5培養(yǎng)展的三用瓶中，在37T悄況下，當IPTG 終濃度為0.6 mmol-l/'時，人/y懇因的表達量聶大。當再增加1PTG的濃度時，抑制童組蛋白的表達，Westem-blol 分析，所表達的吳白具有擾原特異性。實臉為吏組李氏溶血素的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)關(guān)鍵詞：單枚增生性李斯特桿筋；李氏溶血索；誘導(dǎo)濃度；IPTG;外源要白；表達中圖分類號：S852.6P6.3文獻標識碼：A第2期鄒運明3：

3、IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-第2期鄒運明3： IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-單核增生件李斯特桿菌（Listeria moiutcyto - 繆，LMO）是引起食源件疾病的幣:要細菌.在世 界各地都冇污染食品的報道。大聯(lián)的食物中都有 李氏桿菌的存在，牛奶和奶制品通常和步斯特桿 菌的爆發(fā)有關(guān)，其中，軟奶酪制品是污染最多的° 所以，對LMO的研究在公共衛(wèi)生上具有幣:要意義° 李氏溶血（Lisleriolysin 0, LLO）是一種細胞廷素， 是致病性李斯待桿菌分泌的主要毒力因子叫 細菌 利用它來逃離宿主吞噬空泡。單核增生性李斯特 菌

4、被吞噬泡吞噬（內(nèi)化）后,通過LIQ在吞噬泡膜 卜打孔而導(dǎo)致大帚鐵離子和其他大分子物質(zhì)流出。 膜被溶解后，細菌進入胞漿內(nèi)。因此，LLO在 LMO的致病過程中起肴決定性作用° LLO可以從 LMO的培養(yǎng)上清中分離得到，但這樣做需要人話 的培養(yǎng)基,既浪費時問，產(chǎn)武又十分低。苴到現(xiàn) 在,報道的從每升的培芥基中獲得的純化的LLO 僅為22.0,】3.252.0憾叫 為了滿足進-步的實 驗要求，我們需要在優(yōu)化表達上下功夫。本文利用已篩選的質(zhì)粒、菌株，在外源基因 結(jié)構(gòu)固定的情況K對影響喪達主要條彳一誘 導(dǎo)劑異丙基硫代0-半乳糖棄仃P(guān)TG）濃度進行研收稿日期：2004-12-25 -作者簡介：鄒運明

5、（I974-）男.照龍江人.碩.研究生.研究方向為免疫與分子生物學(xué):.E-mail: zymimc518y&hoo. com. cn通訊作者究、，通過不同IPTG濃度誘導(dǎo)對表達的影響.尋找 適宜的IPTG誘導(dǎo)表達濃度.從而人鍛的表達目的 產(chǎn)物。為進一步研究LMO分子生物學(xué)特性，乍氏桿 菌病的發(fā)病機理，李氏桿菌的檢測提供必要條件。1材料和方法1.1菌種已鑒定含陽性質(zhì)粒pGEX-6P-hly的大腸桿菌 BL-21由東北農(nóng)業(yè)人學(xué)微生物教研室保存。1.2抗體一抗由本實驗空利用單核增牛性李氏桿菌活菌 體免疫小門鼠制備，山羊抗鼠酶標二抗購ITI匕京中 杉金橋生物技術(shù)有限公司C1.3材料Marker

6、購于匕海生丄，丙烯醜胺購于Sig- ma公司，異丙基硫代半乳糖仔（1PTG）購于TaKaRa 公司。硝酸纖維素膜（NC膜），Whatman 3M濾紙 購自美國Pall公司。1.4方法1.4.1苗種活化與培養(yǎng)將保留的陽性菌種從-X6、：冰箱中取出，劃線 接種含Amp的LB平板，挑取單個閑落，接種于 含有Amp的5 ml. LB液體培養(yǎng)基中，37乞振蕩培 養(yǎng)過夜；取培養(yǎng)過夜的陽性轉(zhuǎn)化了分別按1 ： 100比 例接種含lOOmL的LB培芥液的二:角瓶中，230 r-min ', 37 X.培養(yǎng)到OD值等于0.5時，取IPTG 誘導(dǎo)前菌液保存。另外分別加入IPTG至終濃度為 0.2, 0.4,

7、 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol -L-1 誘導(dǎo)2.5 h,同時檢測值，記錄。1.4.2 樣品處理與 SDS-PAGE 電泳及 Wcslern-bJot 分析取IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后時間菌液各I n)L, 12 000 rTnin-1離心5 min,棄上清獲得菌體沉淀， 根據(jù)檢測00值，加入IxPBSCODO p<L)及等量 2xSDS凝膠加樣緩沖液(含IHT),允分混勻，煮沸 5 min。取10 |iL k樣，以蛋白質(zhì)標準分子雖為參 考，在分離膠濃度為12%的情況F進行SDS-PAGE 電泳分析叫利用BandScan軟件分析蛋白表達就。 并轉(zhuǎn)印到硝酸

8、纖維素膜上，進行Western-blot分析叫96 ku67 ku86 ku冰道I誘導(dǎo)前陽性車組子；泳逋2蛋門質(zhì)低分子Gt標準；泳道3 I0-IPTG 濃度分別為 0.2,0.4. 0.6. 0.8. 1.0. 1.2, A. 1.6 mmoblAIne I -Expressed pGEX -6?-hlv/Bl21 non-induced; l,ane 2-Prolein molecular weight standards： Lane 3*10-ExprcsMxl pGEX-6p-h)v/BI21 induced in IPTG 0.2, 0.4. 0.6. 0& I Q 1.2,

9、14 1.6 mmol-L I圖1不同IPTG誘導(dǎo)濃度對風(fēng)y基因表達影響的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of expression of My gene atdifference IETG induction concentration2.2 Western-blotting檢測表達蛋白抗原特異性由圖2可見.在轉(zhuǎn)印膜接近86ku處與單核增 生性李斯特桿菌(LMO)制備的一抗發(fā)生特異性反 應(yīng)。表明表達的巫組融合蛋白與LMO分泌的天然 乍氏溶血索一樣都具冇良好的免疫反應(yīng)原性。3討論單核增生性李斯持桿菌是引起食源性疾病的 重要細菌和之一，該菌對環(huán)境抵抗力極

10、強，在低 溫(4 P)和高鹽(20%)的情況下都能生氏良好并產(chǎn) 生致病力叫當前，在世界各地都有污染食品的報2結(jié)果與分析2.1不同IPTG誘導(dǎo)濃度對hly基因表達的影響本實驗所采用的載體PGEX-6P-1是一種融合 蛋白表達載休，其表達的融合蛋白N末端帶有谷 光廿肽硫基轉(zhuǎn)移酶(GST)。天然李氏溶血索的分子 量是58.6 ku左右，谷胱昔肽筑基轉(zhuǎn)移酶分子啟是 28ku左右。所以我們的目的蛋白應(yīng)為86 ku左右。 根據(jù)圖1所示，由左到右IPTG濃度分別足0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol-Vo 利用 BandScan軟件分析，目的蛋白的表達量分別

11、為 105%, 182%, 226%, 192%, 18.7%, 18D%, 145%, 12.4%。所表達的蛋白分子雖接近預(yù)期蛋口的分子 量大小。I .23泳逍誘導(dǎo)前PE性履組子；泳道2-蛋白質(zhì)低分子從標準； 泳道3陽性賈組子誘呂后I-anc I -Expressec： jXiEX -6p-My/BL-21 non-induced; (ane 2- Prolcin molecular weight standards; Lane 3 -Expressed pGEX - 6|>-hly/BI4-21 in<lucr<l圖2 Western-blotting檢測表達蛋白抗原特異

12、性結(jié)果Fig. 2 Western-blotting detection of antigenicspecificty of the expressed protein道。所以此細菌越來越受到我國及世界各地科學(xué) 家的重視。重組至氏溶血素的獲得為李氏桿菌的 檢測和李氏桿菌病診斷開辟了新的途徑叫本研究通過實驗證明在LB液體培養(yǎng)基條件 下，IPTG在誘導(dǎo)重組李氏溶血素表達的最佳濃度 為0.6 mmol-L-*.在此基礎(chǔ)上增加濃度不會增加表 達量。這樣，不但節(jié)省了丁業(yè)化生產(chǎn)時的IPTG成 本，史減少了 IPTG本身的毒性對基囚工程藥物應(yīng) 用的影響稈度。另外.有許多因素都會影響外李 氏溶血素的表達，例如

13、培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo) 前的菌液0值等。尚需進一步實驗去探索。實驗表達的李氏溶血索融合蛋白其N末端帶 有谷光昔肽疏基轉(zhuǎn)移酶（GST）t Western-blot證明， 表達的蛋白具有反應(yīng)原性。這說明，表達的融合 蛋門可作為良好的診斷抗原。為研究分子診斷試 劑提供了理論依據(jù)，另外，融合蛋白可用Prescission Protease切開。切開后的溶液町苴接通過GST 親利柱除去GSTO表達外源蛋口在大腸桿菌內(nèi)可形 成包涵休，同樣有利于李氏溶血素的純化。參考文獻I J （looper J. Walker R D LiMeriosis J|. Vet Clin North Am FoodAnim P

14、rart. 1998114): 113-125.2 Cosrart P. Bicmr H. The u?»r of hoM cell machinery in the palho- genesiH of Listens nu)noc)lopenes J(:urr Opin Inunun, 200!(13): 96-103|3|盧勝棟現(xiàn)代分孑生物學(xué)實峻技術(shù)M.2版北京：中國協(xié)和 大學(xué)出版社 I999.I 4 I薩姆布魯克J.找塞爾I) W.分于克隆實臉指南 m 3版北 恥科學(xué)出版社.2(X)2.(5 Palmer M The family of thiol-nctivalr<l,

15、 chul«*fmJ-binding cy- tolymn (JJ. Uoxicon, 200I. 39: I6KI-I6X9.| 6 lew J G Donachie W. A review of Liberia nu)iuKand li*(erioRis JJ. Vol J. 1997, 153: 9-29.第2期鄒運明3： IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-第2期鄒運明3： IPTG誘導(dǎo)濃度対審組李氏溶血素表達的影響 201-Effect of induced concentration of IPTGon the expression of recombin

16、antListeriolysin OZOU Yunming, MA Wulong, GAO Shenyang, REN Yanhong, !J Yijing(Collrgr of VHerimiry Medicine. NortheuM Agricultural University. Harbin Heilongjiang 150030, PRC )Abstract: The recombinant of pGEX6Phly was transformed into E. coli BI-21, induced and expressed by IPTG, to analyze the ef

17、fect of different concentration of IPTG on the expression of recombinant l-isteriolysin O, and to confirm the best induced concentralion of IPTG Experimental results indicated that under shake incubator, LB medium and inducing 2.4 hours with 37 hly expression quantity was the most when ultima concentration of IPTG was 0.6 mmol L Western-blot analysis showed that recombinant fusion pr