基因組學(xué)及基因組工程

1、 第四章第四章 基因組學(xué)與基因組工程基因組學(xué)與基因組工程Genomics and Genomics Engineering 1 1 基因組學(xué)概況基因組學(xué)概況2 2 基因組圖譜的構(gòu)建基因組圖譜的構(gòu)建3 3 功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)4 4 主要生物基因組研究進(jìn)展主要生物基因組研究進(jìn)展5 5 基因組工程基因組工程6 6 生物芯片生物芯片1 1 基因組學(xué)概況基因組學(xué)概況基因組(genome):一個(gè)物種的一套完整遺傳物質(zhì),包括核基因組和細(xì)胞質(zhì)基因組。核基因組:一個(gè)物種的單倍體所擁有的一套完整的染色體；細(xì)胞質(zhì)基因組:一套完整的細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)，其上攜帶的基因稱為細(xì)胞質(zhì)基因。通常所說的基因組一般指的是核基

2、因組。研究基因組的學(xué)科就是基因組學(xué)。cDNA基因組指的是能夠轉(zhuǎn)錄翻譯的DNA序列。人類染色體基因組(核基因組)24條染色體, DNA 約 3 10 9 堿基對（30億）編碼基因:約有50000個(gè)，占總長的1%.Chr. Mb人類線粒體基因組2個(gè)rRNA基因和22個(gè)tRNA基因，13個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因，編碼序列占93%,有許多拷貝。 CO I-III: Cty c oxidase subunites genes ; ATP 6 and 8: ATPase genes ND1-6: NADH reducase subunites genes 12SrRNA and 16SrRNA genes tRN

3、A genes19861986年提出，至今年提出，至今2020年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學(xué)中最重要的分支學(xué)科。學(xué)中最重要的分支學(xué)科。研究基因組研究基因組結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)和和功能功能的科學(xué)。包括對所有的科學(xué)。包括對所有基因進(jìn)行基因組作圖基因進(jìn)行基因組作圖( (包括遺傳圖譜、物理圖包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜譜、轉(zhuǎn)錄圖譜) )，核苷酸序列分析，基因定位，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析。和基因功能分析。 基因組學(xué)研究的最終目標(biāo)基因組學(xué)研究的最終目標(biāo)u 獲得生物體全部基因組序列（獲得生物體全部基因組序列（結(jié)構(gòu)基因組結(jié)構(gòu)基因組學(xué)學(xué)） 釣魚與涸澤而漁釣魚與涸澤而漁 u 鑒定所有基因的功能

4、（鑒定所有基因的功能（功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)）u 明確基因之間的相互作用關(guān)系明確基因之間的相互作用關(guān)系u 闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律CREDIT: JOE SUTLIFF Science, Vol 291: 1221.Fishing in a More Effective Way!q 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)q 功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)(functional genomics)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics） 基因定位基因定位 基因組作圖基因組作圖 測定核苷酸序列測定核苷酸序列功能基因組學(xué)（功能基因組

5、學(xué)（functional genomics） 又稱后基因組學(xué)（又稱后基因組學(xué)（postgenomics)postgenomics)q 基因的識別、鑒定、克隆基因的識別、鑒定、克隆q 基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系q 基因表達(dá)調(diào)控的研究基因表達(dá)調(diào)控的研究2 基因組圖譜的構(gòu)建基因組圖譜的構(gòu)建基因組計(jì)劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列基因組計(jì)劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列但是，現(xiàn)在的測序方法每次只能測但是，現(xiàn)在的測序方法每次只能測80080010001000bpbp大量的測序片段要拼接大量的測序片段要拼接要知道序列在要知道序列在ChrChr上的位置才能正確拼接上的位置才能正確拼接基

6、因組計(jì)劃的第一個(gè)環(huán)節(jié)：基因組計(jì)劃的第一個(gè)環(huán)節(jié)： 構(gòu)建基因組圖譜構(gòu)建基因組圖譜基因組圖譜基因組圖譜 遺傳圖譜（遺傳圖譜（genetic mapgenetic map）：是以具有多態(tài)性的是以具有多態(tài)性的遺傳遺傳標(biāo)記標(biāo)記作為作為“位標(biāo)位標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離為，以遺傳學(xué)距離為“圖距圖距”的基因的基因組圖。組圖。 物理圖譜（物理圖譜（physical mapphysical map）：是利用限制性內(nèi)切酶：是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成數(shù)個(gè)片段，根據(jù)重疊序列把片段連接成將染色體切成數(shù)個(gè)片段，根據(jù)重疊序列把片段連接成染色體，確定遺傳標(biāo)志之間物理距離染色體，確定遺傳標(biāo)志之間物理距離 堿基對堿基對(bp)(bp)

7、或或千堿基千堿基(kb)(kb)或兆堿基或兆堿基(Mb)(Mb)的圖譜。的圖譜。 序列圖序列圖 （Sequence mapSequence map）：）：整個(gè)物種基因組的整個(gè)物種基因組的DNADNA序列圖序列圖( (最詳盡的物理圖最詳盡的物理圖) )。 轉(zhuǎn)錄圖譜（轉(zhuǎn)錄圖譜（transcription map transcription map ）：）：由基因轉(zhuǎn)錄本由基因轉(zhuǎn)錄本mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄建立反轉(zhuǎn)錄建立cDNAcDNA文庫，通過文庫，通過cDNAcDNA克隆測序得到克隆測序得到基因組的表達(dá)序列圖譜?；蚪M的表達(dá)序列圖譜。遺傳圖譜遺傳圖譜（genetic map） 采用采用遺傳分析的方法

8、遺傳分析的方法將基因或其它將基因或其它DNADNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。遺傳標(biāo)記（Genetic marker）: 通常將可識別的“等位基因”稱為遺傳標(biāo)記；經(jīng)典遺傳學(xué)現(xiàn)代遺傳學(xué)形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記 形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等 又稱表型標(biāo)記又稱表型標(biāo)記 數(shù)量少數(shù)量少 很多突變是致死的很多突變是致死的 受環(huán)境、生育期等因素的影響受環(huán)境、生育期等因素的影響q 最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏?zhàn)钤缃⒌墓夁B鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)

9、系及遺傳距離，繪色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的。制而成的。q 控制性狀的其實(shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記?？刂菩誀畹钠鋵?shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記。果果蠅蠅連連鎖鎖圖圖細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記v 明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征 染色體的核型染色體的核型 染色體的帶型染色體的帶型 染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的結(jié)構(gòu)變異 染色體的數(shù)目變異染色體的數(shù)目變異v 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境影響不受環(huán)境影響v 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對生物體的生長發(fā)育不利數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對生物體的生長發(fā)育

10、不利生化標(biāo)記生化標(biāo)記v 又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記v 就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。 如：同工酶、貯藏蛋白如：同工酶、貯藏蛋白v 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小數(shù)量較多，受環(huán)境影響小v 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息異性、只反映基因編碼區(qū)的信息DNADNA分子標(biāo)記分子標(biāo)記簡稱分子標(biāo)記簡稱分子標(biāo)記以以DNADNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v 不受時(shí)間和環(huán)境的限制不受時(shí)間和環(huán)境的限制v 遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無限遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無限v 不影響性狀表達(dá)不影

11、響性狀表達(dá)v 自然存在的變異豐富，多態(tài)性好自然存在的變異豐富，多態(tài)性好v 多數(shù)共顯性，能鑒別純合體和雜合體多數(shù)共顯性，能鑒別純合體和雜合體限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）v DNADNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對等位基因的差異。對等位基因的差異。 v 如有兩個(gè)如有兩個(gè)DNADNA分子（一對染色體），一個(gè)具分子（一對染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒有這個(gè)有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的位點(diǎn)，酶切后形成的DNADN

12、A片段長度就有差異，片段長度就有差異，即多態(tài)性。即多態(tài)性。v 可將可將RFLPRFLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。位置上。v人類基因組中有人類基因組中有10105 5個(gè)個(gè)RFLPRFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。只有兩個(gè)等位基因。RFLPRFLP分分析析RFLPRFLP標(biāo)記位共顯性標(biāo)記標(biāo)記位共顯性標(biāo)記微衛(wèi)星（微衛(wèi)星（microsatellitemicrosatellite）標(biāo)記標(biāo)記v微 衛(wèi) 星 又 稱 為 簡 單 重 復(fù) 序 列 （微 衛(wèi) 星 又 稱 為 簡 單 重 復(fù) 序 列 （ s i m p l e s i m p l e sequ

13、ence repeatsequence repeat，SSRSSR）。）。v這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2 2個(gè)、個(gè)、3 3個(gè)或個(gè)或4 4個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸v如一條染色體如一條染色體TCTGAGAGAGACGCTCTGAGAGAGACGC 另一染色體另一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就就構(gòu)成了多態(tài)性。構(gòu)成了多態(tài)性。不同個(gè)體的DNA指紋圖譜利用DNA指紋進(jìn)行親子鑒定父親 孩子 母親利用DNA指紋確定罪犯遺傳圖譜的構(gòu)建方法遺傳圖譜的構(gòu)建方法 v 理論基礎(chǔ)理論基礎(chǔ): 連鎖與交換連鎖與交換v 基

14、本方法基本方法: 兩點(diǎn)測驗(yàn)法和三點(diǎn)測驗(yàn)兩點(diǎn)測驗(yàn)法和三點(diǎn)測驗(yàn)法法植物遺傳圖譜的構(gòu)建植物遺傳圖譜的構(gòu)建v 選擇研究材料（親本）選擇研究材料（親本）v 構(gòu)建分離群體構(gòu)建分離群體v 遺傳標(biāo)記檢測遺傳標(biāo)記檢測v 標(biāo)記間的連鎖分析標(biāo)記間的連鎖分析A Chromosome Map of Tomato選擇親本選擇親本 要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大 但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。 對備選材料進(jìn)行多態(tài)對備選材料進(jìn)行多態(tài)( (差異差異) )性檢測，綜合測定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的性檢測，綜合測定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺傳作圖親

15、本。一對或幾對材料作為遺傳作圖親本。構(gòu)建作圖群體構(gòu)建作圖群體 群體的類型1）F2群體F1P1P2F22）BC1群體3）RIL群體 RIL（recombinant inbred lines，重組近交系）群體是雜交后代經(jīng)過多代自交而產(chǎn)生的一種作圖群體，通常從F2代開始，采用單粒的方法建立。常自交6-7代。4）DH群體 高等植物的單倍體是含有配子染色體的個(gè)體。單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的二倍體稱為加倍單倍體或雙單倍體。5）NIL（near-isogenic line ）群體一組遺傳背景相同或相近，只在個(gè)別區(qū)段存在差異的株系，稱為近等基因系（Near-isogeneic linesNIL）。 多代回交后

16、自交一次即得回交自交品系。6） F1群體兩個(gè)雜合親本雜交產(chǎn)生的復(fù)合雜交群體（ CP群體），擬測交（Pseudo-testcross）群體。遺傳標(biāo)記的染色體定位遺傳標(biāo)記的染色體定位v 利用遺傳學(xué)方法或其它方法將少數(shù)標(biāo)記錨利用遺傳學(xué)方法或其它方法將少數(shù)標(biāo)記錨定在染色體上，作為確定連鎖群的參照系。定在染色體上，作為確定連鎖群的參照系。v 常用的方法：常用的方法： 單體分析單體分析 三體分析三體分析 代換系分析代換系分析 附加系分析附加系分析 依據(jù)染色體劑量的差異將遺傳標(biāo)記定位在特定染色體上。即當(dāng)供體材料總DNA等量時(shí)，DNA雜交帶的信號強(qiáng)弱與該標(biāo)記位于的染色體劑量成正比。標(biāo)記間的連鎖分析標(biāo)記間的連鎖

17、分析v 利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個(gè)體的基因型利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個(gè)體的基因型v 根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離v 有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用連鎖圖譜構(gòu)建的理論是染色體的交換和重組。AABBabababABABabABba重組率可用來表示遺傳圖距，基因重組和連鎖理論重組型配子的最大比例為50% ，變化0-50%。圖距單位用厘摩（centi-Mergan, cM） 表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。兩位點(diǎn)存在連鎖(r0.5)的概率與不連鎖的概率(r=0.

18、5)比 為確定兩位點(diǎn)之間存在連鎖，一般要求似然比大于1000，即LOD3；而否定連鎖的存在，則要求似然比小于100，即LOD2。圖譜制作的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理兩點(diǎn)測驗(yàn)L(r)/ L(0.5)概率之比可用似然比統(tǒng)計(jì)量來表示似然函數(shù)L()多點(diǎn)測驗(yàn)一個(gè)位置上所發(fā)生的交換會減少其周圍另一個(gè)單交換的發(fā)生。圖距x與重組率間的關(guān)系當(dāng)r=0.2時(shí)，x=21.2cM。交換干涉與作圖函數(shù)交換干涉干擾的程度可用符合函數(shù)C表示。作圖函數(shù)Kosambi作圖含數(shù)： QTL定位軟件 Mapmaker/QTL1.0Map Manager QTX QTL CartographerWindows CartographerMapQTL水稻遺

19、傳圖v 19941994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜年，水稻第一張高密度遺傳圖譜 927 927個(gè)位點(diǎn)，個(gè)位點(diǎn)， 1383 1383個(gè)標(biāo)記個(gè)標(biāo)記v 1998 1998年，年，11571157個(gè)位點(diǎn)，個(gè)位點(diǎn)，22752275個(gè)標(biāo)記個(gè)標(biāo)記v 2000 2000年，年，32673267個(gè)標(biāo)記個(gè)標(biāo)記v 高密度的遺傳圖譜為基因組測序和遺傳研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。高密度的遺傳圖譜為基因組測序和遺傳研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。人類遺傳圖譜的構(gòu)建v 不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組合，構(gòu)建分離群體！不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組合，構(gòu)建分離群體！v 只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成

20、員的基因型v 家系分析法家系分析法v 資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法現(xiàn)有的人類遺傳圖譜v 1 12222號染色體號染色體v 8 8個(gè)家系個(gè)家系134134個(gè)成員個(gè)成員v X X染色體，染色體，1212個(gè)家系個(gè)家系170170個(gè)成員個(gè)成員v 5364 5364個(gè)個(gè)SSRSSR標(biāo)記標(biāo)記v 2335 2335個(gè)位點(diǎn)個(gè)位點(diǎn)v 標(biāo)記間的平均距離標(biāo)記間的平均距離599599kbkb物理圖譜的構(gòu)建v 用用分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法直接檢測直接檢測DNADNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。v 有遺傳圖譜為什么

21、還要構(gòu)建物理圖譜？有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？ 遺傳圖譜的缺陷v 分辨率有限分辨率有限 人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個(gè)體；測序要求每個(gè)標(biāo)記人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個(gè)體；測序要求每個(gè)標(biāo)記的間隔小于的間隔小于100100kbkb，但實(shí)際是，但實(shí)際是599599kbkb。 精確性不夠經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，交換是隨機(jī)發(fā)生的，但基因組中有些區(qū)域是重組熱點(diǎn)，倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會限制交換重組。酵酵母母遺遺傳傳圖圖與與物物理理圖圖比比較較A 遺傳圖B 物理圖物理作圖的方法物理作圖的方法1 1、限制酶作圖、限制酶作圖2 2、依靠克隆的基因組作圖、依靠克隆的基因組作

22、圖3 3、熒光原位雜交、熒光原位雜交4 4、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖限制酶作圖（限制酶作圖（restriction mapping）限制酶作圖（限制酶作圖（restriction mapping）熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridiz

23、ation，F(xiàn)ISH）人類基因組物理圖人類基因組物理圖v 19871987年，年，RFLPRFLP圖譜，圖譜，403403個(gè)標(biāo)記，個(gè)標(biāo)記，1010MbMbv 1994 1994年，年，58005800個(gè)標(biāo)記，個(gè)標(biāo)記，0.70.7MbMbv 1996 1996年，年，1700017000多個(gè)標(biāo)記，多個(gè)標(biāo)記，100100kbkbv 完全適應(yīng)全基因組測序的要求完全適應(yīng)全基因組測序的要求遺傳圖與物理圖的整合遺傳圖與物理圖的整合v 有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記，又是物理標(biāo)記有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記，又是物理標(biāo)記 RFLPRFLP標(biāo)記標(biāo)記 SSRSSR標(biāo)記標(biāo)記 某些基因序列某些基因序列v 借助這些標(biāo)記可以將遺傳圖和物

24、理圖整合起來借助這些標(biāo)記可以將遺傳圖和物理圖整合起來轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建v 利用利用ESTEST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。v 表達(dá)序列標(biāo)簽（表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTEST）：從）：從cDNAcDNA文庫中隨機(jī)條區(qū)的克隆進(jìn)行測序所獲得的部分文庫中隨機(jī)條區(qū)的克隆進(jìn)行測序所獲得的部分cDNAcDNA的的5 5或或3 3端序列。一般長端序列。一般長300300500bp500bp。EST計(jì)劃的優(yōu)點(diǎn)計(jì)劃的優(yōu)點(diǎn)v 為遺傳圖譜的構(gòu)建提高大量的分子標(biāo)記為遺傳圖譜的構(gòu)建提高大量的分子標(biāo)記v 來自不同組織和器官的來自不同組織和器官的ESTEST為基

25、因功能研究提供了有價(jià)值的信息為基因功能研究提供了有價(jià)值的信息v 為基因的鑒定提供了候選基因?yàn)榛虻蔫b定提供了候選基因EST計(jì)劃的不足計(jì)劃的不足v 隨機(jī)測序有時(shí)無法獲得低豐度表達(dá)的基因和特殊條件下誘導(dǎo)表達(dá)的基因隨機(jī)測序有時(shí)無法獲得低豐度表達(dá)的基因和特殊條件下誘導(dǎo)表達(dá)的基因基因組測序策略基因組測序策略v 有了高密度的基因組圖譜，就可以開始全基因組測序了有了高密度的基因組圖譜，就可以開始全基因組測序了v 測序的技術(shù)飛速發(fā)展，現(xiàn)在可以全自動化測序的技術(shù)飛速發(fā)展，現(xiàn)在可以全自動化v 測序的策略有兩個(gè)：測序的策略有兩個(gè)： 鳥槍法鳥槍法 克隆重疊群法克隆重疊群法鳥槍法（鳥槍法（shotgun sequenc

26、ing）鳥槍法的優(yōu)缺點(diǎn)鳥槍法的優(yōu)缺點(diǎn)v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 不需要高密度的圖譜不需要高密度的圖譜 速度快、簡單、成本低速度快、簡單、成本低v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)域域v主要用于重復(fù)序列少、相對簡單的原核生物主要用于重復(fù)序列少、相對簡單的原核生物基因組基因組克隆重疊群法（克隆重疊群法（clone contig）v 將將基因組基因組DNADNA切割長度為切割長度為0.10.1MbMb1Mb1Mb的大片段，克隆到的大片段，克隆到Y(jié)ACYAC或或BACBAC載體上載體上v 然后再進(jìn)行亞克隆，分別測定單個(gè)亞克隆的序列然后再進(jìn)行亞克隆，分別測定單個(gè)亞克隆

27、的序列v 再裝配、連接成連續(xù)的再裝配、連接成連續(xù)的DNADNA分子。分子。v 這是一種自上而下（這是一種自上而下（up to downup to down）的測序策略的測序策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method兩兩種種基基因因組組測測序序策策略略v 完成基因組測序，僅僅是基因組計(jì)劃的第完成基因組測序，僅僅是基因組計(jì)劃的第一步，更重要的工作在于弄清楚：一步，更重要的工作在于弄清楚： 基因組序列中所包含的全部遺傳信息是基因組序列中所包含的全部遺傳信息是什么；什么； 基因組作為一個(gè)整體如何行使功能?；蚪M作為一個(gè)整體如何行使功能。v就是對基因組

28、序列進(jìn)行詮釋的過程，也就是就是對基因組序列進(jìn)行詮釋的過程，也就是功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容。功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容。 3 功能基因組學(xué)根據(jù)序列分析搜尋基因根據(jù)序列分析搜尋基因 v 查找開放閱讀框（查找開放閱讀框（open reading frame, ORFopen reading frame, ORF）v 開放閱讀框都有一個(gè)起始密碼子開放閱讀框都有一個(gè)起始密碼子，ATGATG，還要還要有終止密碼子有終止密碼子。v 從從ATGATG開始，然后向下游尋找終止密碼子。開始，然后向下游尋找終止密碼子。v 起始密碼子和終止密碼子之間的堿基數(shù)目要能起始密碼子和終止密碼子之間的堿基數(shù)目要能夠被夠被3 3整除整

29、除v 每一條鏈都有每一條鏈都有3 3種可能的閱讀框，種可能的閱讀框，2 2條鏈共計(jì)有條鏈共計(jì)有6 6種可能的閱讀框種可能的閱讀框. .v 計(jì)算機(jī)可以很快給出結(jié)果。計(jì)算機(jī)可以很快給出結(jié)果。同源查詢同源查詢v 利用已經(jīng)存入數(shù)據(jù)庫的基因序列與待查的基因組序列比對，從中查找可以與之利用已經(jīng)存入數(shù)據(jù)庫的基因序列與待查的基因組序列比對，從中查找可以與之匹配的堿基序列及其比例，用于界定基因匹配的堿基序列及其比例，用于界定基因。v 同源查詢可以部分彌補(bǔ)同源查詢可以部分彌補(bǔ)ORFORF掃描的不足。掃描的不足。同源查詢的依據(jù)同源查詢的依據(jù) 有親緣關(guān)系的物種，基因組可能存在某種程度的相似性：有親緣關(guān)系的物種，基因組

30、可能存在某種程度的相似性：v 存在某些完全相同的序列；存在某些完全相同的序列；v ORF ORF的排列相似，如等長的外顯子；的排列相似，如等長的外顯子；v ORF ORF指令的氨基酸序列相似；指令的氨基酸序列相似；v 模擬的多肽鏈的高級結(jié)構(gòu)相似，等模擬的多肽鏈的高級結(jié)構(gòu)相似，等?；蚬δ苎芯炕蚬δ苎芯?1 1、計(jì)算機(jī)預(yù)測基因功能 v 依據(jù)仍然是同源性比較。同源基因擁有一個(gè)共同的祖先基因，它們之間有依據(jù)仍然是同源性比較。同源基因擁有一個(gè)共同的祖先基因，它們之間有許多相似的序列。許多相似的序列。 v 種間同源基因種間同源基因 v 種內(nèi)同源基因種內(nèi)同源基因 基因功能研究基因功能研究2 2、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)

31、基因功能 基因克隆 基因敲除（knock-out） 基因的超表達(dá) 反義RNARNA技術(shù) RNAi RNAi 轉(zhuǎn)座子插入突變 4 主要生物基因組研究進(jìn)展20世紀(jì)人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉 90年代人類基因組計(jì)劃40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類首次登上月球一、 人類基因組計(jì)劃1.人類基因組計(jì)劃的啟動 1986年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者R.Dulbecco（杜爾貝科）提出人類基因組計(jì)劃測出人類全套基因組的 DNA 堿基序列（ 3 109 bp ）。 美國政府決定于 1990年正式啟動HGP，預(yù)計(jì)用 15 年時(shí)間，投入 30 億美元，完成 HGP。由國立衛(wèi)生研究院和能源部共同組成“人類基因組研究所”。 逐

32、漸地，HGP 擴(kuò)展為多國協(xié)作計(jì)劃，參與者包括：英、日、法、德和中國（1993年）。1975年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)2.2.人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展?fàn)顩r人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展?fàn)顩r（1 1）截至）截至 1998 1998 年年 10 10 月，完成月，完成 1.8 1.8 10 108 8bpbp，占計(jì)劃的占計(jì)劃的 6 6。（2 2）完成一系列模式生物全基因組測定。）完成一系列模式生物全基因組測定。 這些模式生物全基因組測定的完成有重大理論這些模式生物全基因組測定的完成有重大理論與現(xiàn)實(shí)意義。與現(xiàn)實(shí)意義。3.DNA 3.DNA 測序技術(shù)飛速提高測序技術(shù)飛速提高 19981998年年5 5月月一批科學(xué)家在美國

33、一批科學(xué)家在美國羅克威爾羅克威爾組建組建塞塞萊拉萊拉(celera)(celera)基因公司基因公司，目標(biāo)是投入億美，目標(biāo)是投入億美元，到元，到20012001年繪制出完整的人體基因年繪制出完整的人體基因 圖譜，圖譜，與國際人類基因組計(jì)劃展開競爭。與國際人類基因組計(jì)劃展開競爭。 接著又有若干家公司成立，總共投入資金約幾十億美元，形成“公”“私”并進(jìn)格局。 2000.6. 完成并公布人類基因組工作框架圖( 90%)。二二000000年六月二十六日克林頓宣布年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成人類基因組草圖繪制完成 美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯柯林斯在介紹情況。人類基因組草圖基本

34、信息人類基因組草圖基本信息 由由31.65億億bp組成組成 含含33.5萬基因萬基因 與蛋白質(zhì)合成有關(guān)與蛋白質(zhì)合成有關(guān) 的基因占的基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì) 61%與果蠅同源 43%與線蟲同源 46%與酵母同源2000年6月公共領(lǐng)域測序計(jì)劃工作框架圖 2001年2月15日由六國科學(xué)家在自然公布了“關(guān)于人類基因組框架圖”的數(shù)據(jù)。 2001年2月16日美國的科學(xué)刊登了Celera Genomics公司的“人類基因組框架圖”的數(shù)據(jù)，并從7個(gè)方面詳細(xì)地介紹了他們的科研情況，并得出5項(xiàng)研究結(jié)論。同時(shí)發(fā)表論文同時(shí)發(fā)表論文 美國美國 Science, Vol. 291, No. 5507 英國英國Nat

35、ure , Vol.409, p.860NATURE 2001, 15 February, Vol 409: 860-921. International Human Genome Sequencing ConsortiumInitial sequencing and analysis ofthe human genomeThe Sequence of the Human GenomeSCIENCE 2001, 16 February Vol 291:1304-1351Celera GenomicsDNA測序膠圖 2003年4月14日，人類基因組序列圖亦稱“完成圖”（99.99%），提前繪制成

36、功。 “炎黃一號” （07.10.11）炎黃計(jì)劃(06年）第一步 繪制中國人的基因組參考圖，命名為“炎黃一號”，現(xiàn)已完成。第二步 再繪制99個(gè)中國人的個(gè)體全基因組序列圖，構(gòu)成中國人群的遺傳和多態(tài)性標(biāo)準(zhǔn)圖譜，成為基因與醫(yī)療和健康的關(guān)鍵組成部分，簡稱“炎黃99”。第三步 在上述基礎(chǔ)上開展大眾的基因與健康的預(yù)測、監(jiān)測及個(gè)體化診斷和治療，實(shí)現(xiàn)解讀基因。 2008年1月，華大基因研究院和國際同行提出“國際千人基因組計(jì)劃”。 萬種微生物基因組計(jì)劃，微生物的基因比人的要少得多，大約有人的千分之一左右，現(xiàn)在華大基因已經(jīng)做了400種左右，4.人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義（1）確定人類基因組中

37、約5萬個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。（4）研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)

38、制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對研究人類基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可能指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。（8）研究染色

39、體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。二、植物基因組1.水稻基因組 1992年，我國在人類基因組計(jì)劃的影響下, 執(zhí)行水稻基因組作圖和測序計(jì)劃。1994年7月，洪國藩院士為首的科學(xué)家小組, 構(gòu)建了水稻基因組庫。1997年1月7日，成功地構(gòu)建了高分辨率的水稻基因組物理圖譜。2000年4月5日，以楊煥明為首的中國科學(xué)家在Science發(fā)表了水稻全基因組框架序列圖。2.擬南芥基因組 擬南芥菜屬十字花科，擬南芥屬，是一種分布

40、很廣的植物，其基因組較簡單，即染色體n=5，核基因組DNA含量=1.0108堿基對。而且生命周期短，種子產(chǎn)量大，即一代的時(shí)間為35周，每個(gè)植株可產(chǎn)生無數(shù)粒細(xì)小的種子，亦有人將之稱為植物中的“果蠅”。 2000年12月14日，由美英等多國科學(xué)家組成的研究小組在英國自然雜志上正式宣布，他們繪出了包含1.3億個(gè)堿基對、約2.5萬個(gè)基因的擬南芥基因的完整圖譜，這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。 3.其它植物基因組黃瓜、玉米、毛竹、毛果楊、葡萄、高粱、大豆、白菜等 三、動物及微生物基因組1996年，完成酵母菌基因組測序。1999年線蟲基因組測序2000年果蠅基因組測序2002年小鼠基因組測序20

41、04年斑馬魚基因組測序2005年家蠶基因組測序2005年綿羊基因組測序2005年“中-丹家豬基因組計(jì)劃” 2009年大熊貓基因組測序世界首張大熊貓基因組序列圖譜（09.10.11）大熊貓基因組與狗的基因組在結(jié)構(gòu)上最為接近，與人也有較大的相似性，在哺乳動物中與小鼠差異較大。大熊貓的基因組與人的基因組大小相似，大熊貓共有21對染色體，約為30億個(gè)堿基對，包含2-3萬個(gè)基因。5 基因組工程一、基因組工程的概念 基因組工程是指利用工程技術(shù)原理，以基因組為基礎(chǔ)，對一類基因群進(jìn)行遺傳操作，從而實(shí)現(xiàn)基因群在受體內(nèi)的整合、表達(dá)的過程。項(xiàng)目基因工程基因組工程目標(biāo)基因單個(gè)或幾個(gè)可達(dá)幾十到幾百、幾千個(gè)DNA長度Kb

42、級Mb級操作手段限制性內(nèi)切酶、連接酶等同源重組片段檢測物理圖譜、序列分析等DNA重疊群、DNA芯片等克隆載體質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、病毒人工染色體導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、注射等細(xì)胞融合、注射、電穿孔克隆宿主大腸桿菌為主大腸桿菌、酵母、哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)宿主各種細(xì)胞、動植物個(gè)體各種細(xì)胞、動植物個(gè)體產(chǎn)物形式蛋白質(zhì)次生代謝產(chǎn)物檢測方式蛋白質(zhì)檢測或酶作用產(chǎn)物分析代謝分析、生物芯片信息水平單個(gè)或幾個(gè)信息系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)信息二、基因組工程與基因工程的差異6 生物芯片一、概述 生物芯片技術(shù)是應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重大需求，在學(xué)科交叉不斷深入的基礎(chǔ)上誕生的，現(xiàn)已成為國際上的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。生物芯片是一種能快速并行處

43、理多個(gè)生物樣品，并對其所包含的各種生物信息進(jìn)行解析的微型器件，其加工運(yùn)用了微電子工業(yè)中十分成熟的光刻技術(shù)和微機(jī)電系統(tǒng)加工中的各類技術(shù)，由于其所處理和分析的對象是生物樣品，故稱為生物芯片。它具有快速、高效、并行處理及分析自動化能力，不僅廣泛用于各研究領(lǐng)域，同時(shí)已出現(xiàn)更多的消費(fèi)型產(chǎn)品進(jìn)入公共衛(wèi)生領(lǐng)域，為食品衛(wèi)生、疾病預(yù)防和預(yù)后提供全新的檢測手段。 二、分類根據(jù)其應(yīng)用領(lǐng)域的不同，生物芯片可分為四大類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。1.1.基因芯片基因芯片基因芯片也叫核酸芯片，是采用原位合成技術(shù)或微量點(diǎn)樣技術(shù)，將數(shù)以百計(jì)或萬計(jì)的DNA探針固著于固相支持物表面，形成二維DNA探針陣列，通過與

44、標(biāo)記過的樣品雜交，然后檢測雜交信號來實(shí)現(xiàn)對生物樣品的快速、并行和高效檢測及分析。目前國內(nèi)外已開發(fā)出的產(chǎn)品有：單核苷多態(tài)性(SNP)檢測芯片和突變檢測芯片、比較基因組雜交芯片、DNA甲基化檢測芯片、信使RNA(mRNA)和小RNA(miRNA)表達(dá)譜芯片等，并在重大疾病發(fā)病機(jī)理、藥物開發(fā)、生長發(fā)育、農(nóng)業(yè)育種、干細(xì)胞研究等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。 核酸雜交的最常用方法： Southern印跡雜交(southern blot ) Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作