實(shí)時(shí)熒光Taqman探針設(shè)計(jì)

1、一、實(shí)時(shí)熒光Taqman探針設(shè)計(jì)總原則：探針選擇要保守，引物選擇要保守，因此必須找一段 100-200bp相對(duì)要保守的片 段來(lái)設(shè)計(jì)引物與探針。即real-time PCR的擴(kuò)增片段是 50bp-150bp 。當(dāng)找不到150bp的保守片段時(shí)，必須確保探針的片段是保守的。在設(shè)計(jì)探針和引物時(shí)，要同時(shí)考慮在兩條鏈上設(shè)計(jì)引物與探針。但要注意的是：在那條鏈上設(shè)計(jì)探針時(shí)，就應(yīng)靠近在同一條鏈上設(shè)計(jì)的引物（即上游引物）。這樣，可保證在將來(lái)擴(kuò)增時(shí)，即便沒(méi)有完全擴(kuò)增，也有熒光信號(hào)報(bào)告出來(lái)。兩者的距離最好是探針的5端離上游引物的3'有一個(gè)堿基，但也可以重疊。若在原序列中找不到合適的探針與引物（1主要是探針和上

2、游引物的距離太遠(yuǎn)，而離下游引物的距離卻較近時(shí)；2突變位點(diǎn)要求在探針的 5'端也能檢測(cè)到熒光信號(hào)，但卻是在3'端），可在互補(bǔ)的序列中設(shè)計(jì)引物與探針。另real-time PCR中的探針和引物的 Tm值，均要高于平常 PCR的引物和雜交的探針的 Tm 值。二、探針的設(shè)計(jì) 探針設(shè)計(jì)的基本原則：1 .保守：探針要絕對(duì)的保守， 有時(shí)分型就單獨(dú)依靠探針來(lái)決定。理論上有一個(gè)堿基不配對(duì)，就可能檢測(cè)不出來(lái)。若找不到完全保守的片段，也只能選取有一個(gè)堿基不同的片段。且這個(gè)不同的堿基最好在探針的中間，對(duì)探針與目的片段的雜交影響不大，不相同的堿基最好不要在兩端，因?yàn)閮啥瞬焕谔结樀碾s交。且最好為A或T,

3、而不能為G或A,因?yàn)锳、T為雙鍵，而G、A為三鍵。2 .探針長(zhǎng)度Taqman探針的長(zhǎng)度最好在 25-32bp之間，且Tm值在68-72 C之間，最好為70 C ,確保探 針的Tm值要比引物的Tm值高出10C,這樣可保證探針在煨火時(shí)先于引物與目的片段結(jié) 合。因此探針最好是富含 GC的保守片段，保證其的Tm值較高?，F(xiàn)在有Taqman MGB探針， 在TAMER之后再標(biāo)記一個(gè) MGB,可使探針的 Tm值較高，即使探針片段較短，也可達(dá)到 Taqman探針的Tm值要求（68-70 C）。3 .探針的名稱應(yīng)標(biāo)記探針在基因組的位置及長(zhǎng)度。4 . 探針Tm值計(jì)算用oligo或primer preiemer軟件

4、即可計(jì)算 Tm值。確保探針中 GC含量在30-80%。應(yīng)避免 探針中多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個(gè)或超過(guò)4個(gè)的G堿基出現(xiàn)。5 .探針的評(píng)價(jià)用 DNAstar 軟件中的 Primerselect 軟件，點(diǎn)擊 “l(fā)og菜單中的 "create primer catalog :在"name中輸入探針的名稱、位置，按 Tab鍵進(jìn)入"sequence,粘貼或輸入要分析的探針序 列。選中整個(gè)序列后， 在"report菜單下“primer self dimer分析探針的二聚體。 彈出的窗口 中就告訴此探針有多少個(gè) dimer ,并對(duì)此探針用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)（通常給

5、出最差的dG值，理 論上是dG值越大越好）。在"report菜單下“primer hairpins ”分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的 窗口中就告訴此探針有多少個(gè)hairpins ,并對(duì)此探針的hairpins進(jìn)行評(píng)價(jià)。多重?zé)晒釶CR時(shí)，要對(duì)多條探針進(jìn)行"pair dimer進(jìn)行分析。6 .探針的5端不能為G,因?yàn)榧词箚蝹€(gè) G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。7 . Taqman探針與引物之間的位置Taqman探針應(yīng)靠近上游引物，即 Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者 的距離最好是探針的 5'端

6、離上游引物的 3'有一個(gè)堿基，但也可以重疊，要保證Taqman探針 的5'端離上游引物的5端至少有4bp。如：forward primer Taqman probe5 ' f 3' 5 '卡 AMfe 料NNNNNNN NNNNNNN發(fā)表序歹 U: 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'互補(bǔ)發(fā)表序列 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 5'NNNNNNN3' 5'reverse primer或：reverse primer

7、5' f 3'NNNNNNN發(fā)表序歹 U: 5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'互補(bǔ)發(fā)表序列 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 5'NNNNNNN NNNNNNN料染 3' MAF5 3 Q 5'Taqman probe forward primerTaqman probe forward primer三引物的設(shè)計(jì)1 .上下游引物要保守為了能夠擴(kuò)增出所需要的保守片段，必須對(duì)保守的 100-200片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所以引物 的選取也要非常的保守， 最好

8、不要有不同的堿基， 若不得不有時(shí)，也必須保證引物的 3'端至 少有4個(gè)堿基是完全保守才可。在設(shè)計(jì)保守引物時(shí)，要在發(fā)表序列上分別找保守一致的區(qū)域， 即在發(fā)表序列的5'端引物位置 找的是3'端至少有5個(gè)bp保守，在即在發(fā)表序列的 3'端引物位置找的是 5'端至少有5個(gè)bp 保守。5' NNNNNNN 3'發(fā)表序歹 U: 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'3' NNNNNNNNN 52 .上下游引物的長(zhǎng)度和 Tm值上下游引物的長(zhǎng)度一般為 18-25bp之間，且Tm值在58-6

9、0 C之間。確保引物中 GC含量在 30-80%。應(yīng)避免引物中多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)， 尤其是要避免4個(gè)或超過(guò)4個(gè)的G堿基出現(xiàn)。 引物的3'端最好不為G或/和C。引物3'端的5個(gè)堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個(gè)G或/和C。上游引物應(yīng)標(biāo)記 F（forword）,且在基因組的位置及長(zhǎng)度；下游引物應(yīng)標(biāo)記R（reverse）,且在基因組的位置及長(zhǎng)度。用 oligo或primer preiemer軟件即可計(jì)算 Tm值。上下防I引物的 Tm 值相差最好不超過(guò) 2C,長(zhǎng)度相差最好不超過(guò) 4bp。3 .引物的評(píng)價(jià)用 DNAstar 軟件中的 Primerselect 軟件，點(diǎn)擊 “l(fā)og菜單中的 "cr

10、eate primer catalog :在"name中輸入引物的名稱、位置，按 Tab鍵進(jìn)入"sequence,粘貼或輸入要分析的引物序 列。選中整個(gè)序列后， 在"report菜單下“primer self dimer分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個(gè)dimer ,并對(duì)此引物用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)（通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好）。在"report菜單下“primer hairpins ”分析引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的 窗口中就告訴此引物有多少個(gè) hairpins ,并對(duì)此引物的hairpins進(jìn)行評(píng)價(jià)。再選擇所需要的 上下游引物，

11、在 "report菜單下“primer pair dimers分析上下游引物的 dimers。彈出的窗口 中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè)dimer ,并對(duì)此對(duì)引物用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)（通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好（dG值通常為負(fù)值），絕對(duì)值超過(guò)4.5kcal/mol易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚 體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行）。不必考慮引物與探針之間的配對(duì)與發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因?yàn)樘结樀腡m值非常之高。4 .上下游引物與探針的距離（上下游引物的位置）理論上講，上游引物的3'端離探針的5端為1-20bp ,最佳是1bp,最近為上游引物的 3端離探針的3'端為4b

12、p；下游引物要與探針有一定的距離，但要保證下游引物的3'端離探針的3端最為15-150bp 。整個(gè)目的片段的長(zhǎng)度最好在50-150bp之間，最長(zhǎng)不超過(guò) 200bp。5 .簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)當(dāng)為了能夠同時(shí)擴(kuò)增即使在引物位點(diǎn)也有突變的目的片段，若多個(gè)堿基出現(xiàn)的概率相同， 就要在此位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一個(gè)代表多個(gè)堿基的簡(jiǎn)并子。在合成引物時(shí)，在合成到此位點(diǎn)時(shí)，就不是 加入一個(gè)堿基，而是同時(shí)加入簡(jiǎn)并子所代表的多個(gè)堿基。這樣，實(shí)質(zhì)合成的引物是多條引物，只不過(guò)是在簡(jiǎn)并子位置堿基不同而已。但簡(jiǎn)并引物要考慮每條引物的 Tm值，確保簡(jiǎn)并子所代表的不同堿基的不同引物 Tm值相差不超過(guò)2C。若超過(guò)2 C,在確保引物的3&#

13、39;端引物相 同時(shí)，在Tm值較低的堿基引物的 5'端加入幾個(gè)堿基，使其的 Tm值相同。但這時(shí)就不是簡(jiǎn) 并引物，而是分別合成長(zhǎng)度不同，簡(jiǎn)并子位點(diǎn)堿基不同，但Tm值相同的兩條引物，最后在進(jìn)行等濃度的混合即可。5' f 3'NNNANNNNNNGNNN序歹 U: 5'-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN- 3'RR四、 實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇：1 .多重實(shí)時(shí)PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測(cè)時(shí)可根據(jù)熒光的顏色來(lái)判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目的片段，

14、反應(yīng)中加入 SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片段的Tm值來(lái)判定不同的物2 .多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時(shí)為T(mén)aqman探針、或同時(shí)為MGB探針、或同時(shí)為Beacon探針。3 . MGB探針的優(yōu)點(diǎn)：a.MGB探針較短（14-20bp）,更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。b.短片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10 C,更容易達(dá)到熒光探針 Tm值的要 求。4 . MGB探針的設(shè)計(jì)原則1）探針的5端避免出現(xiàn)G,即使探針?biāo)鉃閱蝹€(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的 G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。2）用primerexpress 軟件評(píng)價(jià) Tm值，Tm值應(yīng)為65-67 C

15、。3）盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長(zhǎng)度不少于13bp。4）盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn) 4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。5）原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)）。因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即Taqman MGB 不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡 量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的 4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向3'端移 動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離 3端2個(gè)堿基白前方（即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是絕對(duì)的保守）,以進(jìn)行S

16、NP檢測(cè)。反過(guò)來(lái)，若要進(jìn)行同類檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位 點(diǎn)。若探針即便是只有 13個(gè)bp,探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針 的5'端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì) 簡(jiǎn)并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測(cè)到突變。5 .在多重PCR中，多重PCR的各個(gè)引物之間相互干擾和各個(gè)探針之間相互干擾分析設(shè)計(jì)好各對(duì)引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開(kāi)保守在同一文件中的多重 PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重引物或兩兩分別選中所設(shè) 計(jì)的多重探針后，在 "report菜單下“primer pair dimers分析上下游引物的 dimers。彈出的 窗口中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè)dimer ,并對(duì)此對(duì)引物用 d