引物設(shè)計(jì)原則及PP5.0設(shè)計(jì)軟件

1、引物設(shè)計(jì)原則及設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則及設(shè)計(jì)軟件軟件引物（primers) 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。3355Sense primerAntisense primerSense primerAntisense primer選擇模板序列保守區(qū)域選擇模板序列保守區(qū)域1、引物設(shè)計(jì)原則 引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物3端 引物5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 自由能分布引物長度 一般引物的長度為15-30 bp，常用的長度為18-21bp。過長或過短都不合適，為過長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于7

2、4，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。引物過短會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（18bp的序列在人類基因組中只會(huì)出現(xiàn)一次）。決定引物退火溫度（決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度值）最重要的因素就是引物的長度Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè) GC含量一般40-60%，以45-55為宜 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。堿基分布的均衡性有一些模板本身的

3、有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及含量以及Tm 值保持接近值保持接近（上下游引物的（上下游引物的GC含量不能相差太大）含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。，以有利于退火溫度的選擇。引物Tm值 一般要求：55-65。 應(yīng)盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異控制在2 以內(nèi)。 （引物的退火溫度相差小于5一般不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在5580間變化，有說接近72為最佳） 上下游引物Tm值與產(chǎn)物Tm值一般

4、應(yīng)控制在20 以內(nèi)。 一般采用較低引物Tm值-5作為PCR退火溫度。一對(duì)引物的一對(duì)引物的GC含量和含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或傾向或AT傾向則可以傾向則可以在引物在引物5端加適量的端加適量的A、T或或G、C尾巴。若尾巴。若G+C含量太低，可在含量太低，可在5端加上一些端加上一些G或或C，若若GC含量太高，可在含量太高，可在5端加上一些端加上一些A或或T。引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物二聚體（引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性 ） 盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3端有較多堿基互補(bǔ) 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3端形

5、成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。（兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好，引物中間或5端可適當(dāng)放寬）兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物3端 引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。 引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間3端的互

6、補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。3端的連續(xù)端的連續(xù)3 3個(gè)個(gè)G 或或C ，如如GGG或或CCC，會(huì)導(dǎo)致引物在會(huì)導(dǎo)致引物在G+CG+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)引發(fā)引物5端 引物5端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基（對(duì)對(duì)PCR 影響不影響不大）大），常在5端引入修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。 5端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。 5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。雙酶切位點(diǎn)，有利于定向克隆，2-3個(gè)保護(hù)堿基，一般加CG。計(jì)算引物Tm 值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該

7、對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測。 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3端最好為G或C。 現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T（有說不適宜用A），少用G或C。 若模板不很清楚，引物若模板不很清楚，引物3端最后一個(gè)堿基最好為端最后一個(gè)堿基最好為T，其次是其次是G或或C，而而不選不選A，國外資料表明，當(dāng)末位為國外資料表明，當(dāng)末位為T時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下也能引發(fā)鏈的時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為合成，而末位為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)大大降低，時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)大大降低，G G

8、或或C居中，可見，模板很清居中，可見，模板很清楚時(shí)選楚時(shí)選A可以提高特異性可以提高特異性。自由能分布G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性（結(jié)合的強(qiáng)弱程度結(jié)合的強(qiáng)弱程度）。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對(duì)較低，且不要超過9 （絕對(duì)值，一般考慮末端5個(gè)堿基的G。此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。因此在復(fù)雜模板的擴(kuò)增體系中，3末端5聚體的G應(yīng)大于-9.0kcal/mol） ，如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止，如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。錯(cuò)誤

9、引發(fā)。引物的3端的G 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合能值越高越容易結(jié)合）33末端雙鏈的末端雙鏈的GG是是0 02 2 kcal/molkcal/mol時(shí)，時(shí)，PCRPCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6 6時(shí)只有時(shí)只有40%40%、到、到8 8時(shí)少于時(shí)少于20%20%、而、而1010時(shí)接近于時(shí)接近于0 0。引發(fā)效率（引物唯一性） 選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列 好的設(shè)計(jì)工具會(huì)提供一個(gè)引物異位引發(fā)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，好的設(shè)計(jì)工具會(huì)提供一個(gè)引物異位引發(fā)的評(píng)

10、價(jià)指標(biāo)，如如Oligo 6.0 Oligo 6.0 的的false priming efficiencyfalse priming efficiency，即異位引發(fā)即異位引發(fā)效率，這個(gè)值是由程序根據(jù)引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量、錯(cuò)效率，這個(gè)值是由程序根據(jù)引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量、錯(cuò)配的類型、錯(cuò)配離配的類型、錯(cuò)配離33末端的距離等因素綜合計(jì)算而得出，末端的距離等因素綜合計(jì)算而得出，當(dāng)此值大于當(dāng)此值大于200200時(shí)便很有可能引發(fā)擴(kuò)增。如所用工具無量時(shí)便很有可能引發(fā)擴(kuò)增。如所用工具無量化指標(biāo)，則可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)引物與模板在非預(yù)期位置退火，化指標(biāo)，則可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)引物與模板在非預(yù)期位置退火，超過超過70%70

11、%的堿基能互補(bǔ)配對(duì)，或引物的堿基能互補(bǔ)配對(duì)，或引物3 3末端連續(xù)末端連續(xù)8 8個(gè)或以個(gè)或以上堿基配對(duì)，則認(rèn)為有引發(fā)的可能。上堿基配對(duì)，則認(rèn)為有引發(fā)的可能。2、引物設(shè)計(jì)軟件、引物設(shè)計(jì)軟件 Oligo 6 （引物評(píng)價(jià)）* Primer Premier （自動(dòng)搜索）* Vector NTI Suit （綜合分析） Primer Express(實(shí)時(shí)定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)) Omiga Dnastar Primer3 （在線服務(wù)）*3、同源序列比較、同源序列比較 NCBINCBI的的BLASTBLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector N

12、TI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等引物同源性分析 用BlastBlast軟件進(jìn)行同源性比較 盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物 選擇3端與非目的基因不同源的序列作為引物 選擇兩個(gè)引物3端與同一非目的基因不同源的序列作為引物參數(shù)設(shè)置默認(rèn)引物長度 - 默認(rèn)值為25引物對(duì)搜索最大值 - 默認(rèn)值為100核酸濃度 -默認(rèn)值為250 pM單價(jià)離子濃度 - 默認(rèn)值為50 mM游離Mg2+離子濃度 - 默認(rèn)值為1.5 mM評(píng)分參數(shù)Rating parameters 評(píng)分參數(shù)窗口是用來設(shè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)在引物評(píng)分中的權(quán)重系數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定引物評(píng)分就會(huì)越低相對(duì)于在引物中間形成的

13、二級(jí)結(jié)構(gòu)來說3 末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響會(huì)更大為了將這一效應(yīng)計(jì)算在內(nèi)軟件將3 末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值G減去1 這一修正會(huì)使3 末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯得更加穩(wěn)定參數(shù)設(shè)置載入序列Preimer Premier 啟動(dòng)界面Load sequence粘貼序列窗口這一窗口使得一段核酸序列通過選擇以四種不同的方式粘貼上去（CTRL-V）基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設(shè)計(jì)界面First you can design the primer manuallySense st