PNH-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測

1、 PNH(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 是一種罕見的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾是一種罕見的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于南方。半數(shù)以上發(fā)生在南方。半數(shù)以上發(fā)生在20-4020-40歲青壯年。男歲青壯年。男性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起病隱襲緩慢，呈慢性過程，以貧血、出血病隱襲緩慢，呈慢性過程，以貧血、出血為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者較少。較少。血紅蛋白尿 睡眠有關(guān)，早晨較重，下午較輕 尿液外觀為醬油或紅葡萄

2、酒樣;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等 原因因為補體作用最適宜的pH是，而睡眠時呼吸中樞敏感性降低，酸性代謝產(chǎn)物積聚 研究歷史 Strubing第一次報道PNH Ham 和Dingle 證明了PNH 患者的紅細(xì)胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就是現(xiàn)在普遍使用的Ham 實驗1983年證實PNH患者GPI合成異常1993年pig-a基因突變流式細(xì)胞術(shù) 原理：X染色體上PIG-A（造血干細(xì)胞經(jīng)獲得性體細(xì)胞基因）突變導(dǎo)致糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙 導(dǎo)致由GPI錨接在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白丟失，包括CD16、CD55、CD59等GPI錨連接蛋白 補體調(diào)接蛋白 衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻

3、擊復(fù)合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補體C8結(jié)合蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。 粘附分子 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3或CD58)、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。GPI錨連接蛋白 酶類 紅細(xì)胞乙酰膽堿脂酶 ( AchE )、中性粒細(xì)胞堿性磷酶酸酶 ( NAP )、5外核酸酶 ( CD 73 )。受體類 中性粒細(xì)胞III型Fc受體 ( FcRIIIb 或CD16 )、單核細(xì)胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纖溶酶原激活物受體 ( u-PAR )。血型抗原 CD55 攜帶的Comer抗原、AchE攜帶的 Yt抗原。 1型細(xì)胞 CD5

4、9完全陽性補體激活途徑 C1 C1C2,C4 C4b2b (C3轉(zhuǎn)化酶） C3 C3b P （備解素） PC3bBb C3bB (C5轉(zhuǎn)化酶）C4b2b3b或PC3bBb C8 C9 C6C7C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC)CD59替代途徑經(jīng)典途徑CD55Ag-Ab分析1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門報告標(biāo)本中CD55、CD59陰性比例做2030份正常人血樣劃定陽性區(qū)（區(qū)）范圍同型陰性對照界定區(qū)范圍，中間的區(qū)域即為區(qū)。根據(jù)CD59可以將PNH細(xì)胞分為3型1型細(xì)胞 CD59完全陽性 正常細(xì)胞2型細(xì)胞 CD59部分陽性 補體中度敏感細(xì)胞3型細(xì)胞 CD59完全陰性 補體敏感細(xì)胞CD

5、55和CD59同時部分或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。CD59重要性大于CD55單CD55缺乏時并不因此改變紅細(xì)胞對補體的敏感性而造成溶血CD59的缺失會增加補體的敏感性臨床上以CD59缺失作為診斷標(biāo)準(zhǔn)是一個趨勢。解決了一切以補體溶血為基礎(chǔ)的實驗診斷方法在診斷PNH的不確定性意義意義其它細(xì)胞的PNH檢測PNH患者的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上GPI錨連膜蛋白部分或全部喪失。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細(xì)胞略早于紅細(xì)胞其它細(xì)胞的PNH檢測應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門分析時會有許多脫顆粒的中性粒細(xì)胞，這時只使用物理特征無法準(zhǔn)確設(shè)定粒細(xì)胞門了

6、，這時必須使用系列標(biāo)志/SSC設(shè)門:CD15，CD33 。 CD64設(shè)門，分析單核CD14,CD55,CD59，PNH病人檢測GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根據(jù)淋巴細(xì)胞上GPI相關(guān)蛋白的表達(dá)來診斷。 與其他實驗比較 1.酸溶血試驗(Ham試驗) 患者紅細(xì)胞與含5%鹽酸的正常同型血清混合，37孵育2小時，溶血明顯。本試驗特異性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血試驗蛇毒因子能通過補體交替途徑，使補體敏感的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。本試驗特異性強，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗。3.熱溶血試驗和蔗糖溶血試驗 因特異性差，常作為篩選方法。具有PNH克隆的血液病 檢測粒細(xì)胞GPI 錨連蛋白表達(dá) 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù)(

7、% ) AA 115 25 ( 22 % ) MDS 39 9 ( 23% )并發(fā)現(xiàn) MDS有 PNH表達(dá)者 ATG（人胸腺細(xì)胞免人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白）疫球蛋白）治療有效 ( An Intern Med 1999，131: 401 ) PNH和AA關(guān)系 相當(dāng)密切，可以相互轉(zhuǎn)化且并存AAPNH較多(15%)，PNHAA少 20%30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治療后)PNH 1031% AA-PNH綜合征 16.5%(我國) 50%AA外周血或骨髓可檢出PNH克隆AAPNH 生存率要高于PNHAAMDS-RA 如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白腺細(xì)胞免疫球蛋白)

8、 )治療有效。PNH對AA和MDS的“自然治療”，而“AA救了PNH” 。PNH 克隆見于淋巴增殖性疾病 檢測病種 例數(shù) NHL 87 HD 55 紅細(xì)胞 CD55/CD59 CLL 49 缺失檢出率 9.2% ALL 22 HCL 4 (Hematol J 2001，2: 33) PNH克隆見于漿細(xì)胞病 檢測紅細(xì)胞 CD55/CD59 缺失 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù) (%) MM 62 6 WM 7 2 MGUS 6 1 HCD 2 1 合計 77 10 (12.9%) (Int J Hematol 2002, 75 :40)FLAER嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。1998年Diep

9、等報道嗜水氣單胞菌(HEC)毒素能特異地與細(xì)胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合，隨后立即聚合成多具體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，在膜上形成孔洞致溶破。PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì)胞完好。FLAERFLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細(xì)胞上都有特異性表達(dá)，所以正常人及非PNH貧血FLAER成100%陽性。是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。FLAER對PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它靶向標(biāo)記檢出率的敏感性為1%；結(jié)果分析1.設(shè)門 CD45/SSC2.標(biāo)記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER檢測PNH粒、單核及淋巴細(xì)胞，報告標(biāo)本中各系細(xì)胞FLAER陰性比例FLAER目前FLAER一般用于有核細(xì)胞的檢測，不能評價紅細(xì)胞的PNH克隆。由于紅細(xì)胞表面沒有氣單胞菌溶素前體產(chǎn)生所需要的蛋白水解酶類，盡管表達(dá)在紅細(xì)胞表面的血型糖蛋白不是錨連蛋白，但是由于血型糖蛋白與氣單胞菌溶素前體結(jié)合力較弱，因此限制了FLAER在紅細(xì)胞中的應(yīng)用。.與與CD55CD55、CD59CD5