分子診斷學(xué)重點(diǎn)內(nèi)容

1、分子診斷學(xué)重點(diǎn)內(nèi)容( Navy )1 、分子診斷學(xué)( molecular diagnostics )是利用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)研究機(jī)體外源性 和內(nèi)源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的改變，從而為疾病的預(yù) 測(cè)、預(yù)防、診治和轉(zhuǎn)歸提供分子水平信息。2 、基因： 是一段攜帶功能產(chǎn)物(多肽，蛋白質(zhì)， tRNA 和 rRNA 和某些小分子RNA )信息的 DNA 片段，是控制某種性狀的的遺傳單位。3 、密碼子偏愛(ài)( codon bias )指在不同物種的基因中經(jīng)常為某種氨基酸編碼的只是 其中的一個(gè)密碼子。當(dāng)鑒別到一個(gè) ORF 時(shí)，密碼子偏愛(ài)常常用來(lái)確定這個(gè) ORF 是否 是一個(gè)基因。4 、基因組

2、( genome )： 指一個(gè)細(xì)胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)。5、C 值矛盾： 生物體的進(jìn)化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象稱為C 值矛盾也稱 C 值佯謬( C value paradox )6、N 值矛盾：基因組中基因數(shù)目與生物進(jìn)化程度或復(fù)雜程度的不對(duì)稱性，稱為N 值矛盾或 N 值佯謬( N value paradox )。7 、基因組計(jì)劃 是指以獲得某物種基因組全序列為主要目標(biāo)的科學(xué)計(jì)劃。8 、厘摩爾根( cM )即重組頻率為 1% 的兩個(gè)基因間的遺傳距離9 、基因組學(xué)( Genomics )指對(duì)所有基因進(jìn)行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖 譜、轉(zhuǎn)錄圖譜)核苷酸序列分析，基因

3、定位和基因功能分析的一門科學(xué)。10 、鑒別蛋白質(zhì)編碼基因的五項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)是什么？ 開(kāi)放閱讀框、密碼子偏愛(ài)、序列保守性、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、基因失活11 、原核生物 是細(xì)菌等原始生物的總稱，是最簡(jiǎn)單的細(xì)胞生物體12 、質(zhì)粒： 獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞染色體以外，能自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA ( cccDNA )分子，稱為質(zhì)粒 (plasmid)13 、瓊脂糖凝膠電泳泳動(dòng)速度：超螺旋 DNA 分子 線性 DNA 分子半開(kāi)環(huán) DNA 分子14 、接合作用 (conjugation) 當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒 DNA 從一個(gè)細(xì)胞(細(xì)菌)轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞(細(xì)菌)的 DNA 轉(zhuǎn)移稱為接合作 (conj

4、ugation) 。15 、轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源 DNA ，使細(xì)胞或培 養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 。16 、轉(zhuǎn)導(dǎo) : 以噬菌體為媒介把細(xì)菌的基因從一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的過(guò) 程.一般是針對(duì)溫和噬菌體 , 溶血性噬菌體則不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo) .17 、轉(zhuǎn)染: 病毒侵入宿主細(xì)胞過(guò)程 . 對(duì)原核生物說(shuō) , 轉(zhuǎn)染是噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程18 、轉(zhuǎn)座： 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座 (transposition) 。19 、轉(zhuǎn)座因子 可移動(dòng)的基因成分，即能在一個(gè) DNA 分子內(nèi)部

5、或兩個(gè) DNA 分子之間 移動(dòng)的 DNA 片段，稱為轉(zhuǎn)座因子 (transposable element )在細(xì)菌中，指可在質(zhì)粒和染色體之間或質(zhì)粒和質(zhì)粒之間可移動(dòng)的 DNA 片段20 、轉(zhuǎn)座因子的分類： 插入序列、轉(zhuǎn)座子、可轉(zhuǎn)座的噬菌體21 、基因轉(zhuǎn)移的方式： 接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染22 、真核生物基因組的一般特征(一)基因組龐大 (二)線狀雙鏈 DNA 和二倍體 (三)非編碼區(qū)遠(yuǎn)多于編碼區(qū)(四)斷裂基因( split gene ) (五)大量重復(fù)序列存在23 、衛(wèi)星 DNA ：由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法 將其與主體 DNA 分開(kāi)，因而稱為衛(wèi)星 DNA (或隨體

6、 DNA )24 、中度重復(fù)序列片段較長(zhǎng)( 100- 幾千 bp) 具有種屬特異性，可作為 DNA 標(biāo)記25 、基因家族 (gene family) 一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因，在進(jìn)化 過(guò)程中從一個(gè)祖先基因經(jīng)重復(fù)和突變演變而來(lái)的。26 、假基因( pseudogene )與具正常功能的基因序列相似，但無(wú)轉(zhuǎn)錄功能或轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物無(wú)功能的基因。27 、所有組蛋白基因都不含內(nèi)含子，而且組蛋白基因序列都很相似，從而編碼的組蛋 白在結(jié)構(gòu)上和功能上也極為相似28 、質(zhì)粒與核 DNA 區(qū)別：1. 非孟德?tīng)柕哪赶颠z傳2. 高突變率 3. 異質(zhì)性和復(fù)制分離4. 閾值效應(yīng) 5. 半自主復(fù)制與協(xié)同作用29

7、 、線粒體?。?由于線粒體呼吸鏈功能不良所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)多樣化的一組疾病。30 、CpG 島：大約有一半的人類基因富含 CpG 的順序，稱為 CpG 島31 、單核苷酸的多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism, SNP)主要用途： 疾病的連鎖分析與基因的定位 指導(dǎo)用藥和藥物設(shè)計(jì) 用于進(jìn)化和種群多樣性的研究32 、短串聯(lián)重復(fù)序列 ( short tandem repeat , STR)STR 在人類基因組內(nèi)平均 15-20kb 就有一個(gè) STR 點(diǎn)位，占基因組的 10% ，多 存在于非編碼區(qū)及內(nèi)含子中。主要用途：人類基因遺傳圖譜的制作。目的基因篩選和基因診斷。法

8、醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。33 、病毒( virus ) 是一類比較原始的、有生命特征的、能夠自我復(fù)制的、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi) 寄生的非細(xì)胞生物，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、最微小的生命形式。34 、末端正向重復(fù)序列 又稱末端冗余( terminal redundancy )是指雙鏈 DNA 分子 兩端有一段相同的核苷酸序列35 、末端反向重復(fù)序列( inverted terminal repeat，ITR )指病毒基因組兩端的反向互補(bǔ)重復(fù)序列。 ITR 可能與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及整合有關(guān)36 、重疊基因： 許多病毒基因組的一段 DNA 序列有兩個(gè)或兩個(gè)以上的開(kāi)放讀碼框 架，可以編碼兩種或兩種以上的多肽鏈，稱為重疊基因3

9、7 、分段基因組： 指病毒基因組由數(shù)條不同的核酸分子組成，多見(jiàn)于 RNA 病毒38 、乙肝病毒( hepatitis B virus，HBV )是目前已知感染人類的最小的雙鏈 DNA病毒39 、RNA 病毒基因組為線狀單鏈或雙鏈，正鏈 RNA 病毒基因組均為線狀 RNA 分子 僅 HDV 的負(fù)鏈 RNA 病毒基因組為環(huán)狀，其余的負(fù)鏈 RNA 病毒均為線狀40 、正鏈 RNA 病毒： 基因組序列與 mRNA 相同，可直接作蛋白質(zhì)合成的模板，此類 RNA 病毒具有侵染能力41、負(fù)鏈 RNA （ -RNA ）病毒： 基因組序列與 mRNA 互補(bǔ)，基因組只有在其核衣殼 蛋白轉(zhuǎn)錄酶存在下，才具有侵染能力

10、42 、蛋白質(zhì)組 是指特定細(xì)胞、組織乃至機(jī)體作為一個(gè)生命單元中所擁有蛋白質(zhì)的集合 即生命體中攜帶的基因信息在某一時(shí)段所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。43 、蛋白質(zhì)組學(xué) 是指對(duì)在特定的時(shí)間和環(huán)境下所表達(dá)的群體蛋白質(zhì)研究的一門學(xué)問(wèn)。 主要在蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)的表達(dá)模式、作用模式、功能機(jī)制、調(diào)節(jié)控制以及蛋 白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用。是在生物體或其細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行的,并從一個(gè)機(jī)體或一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體活動(dòng)來(lái)揭示生命的規(guī)律。44 、二維凝膠電泳 是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分離技術(shù)。它由兩向電泳組成,第一向以蛋白質(zhì)電荷差異為基礎(chǔ)進(jìn)行分離的等電聚焦凝膠電泳,第二向是以蛋白質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)的 SDS- 聚丙

11、烯酰胺凝膠電泳。45、質(zhì)譜技術(shù)是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量、電荷比值（質(zhì)荷比，m/z）差異來(lái)確定分子量的技術(shù)。46 、凝膠滯后實(shí)驗(yàn) 是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用聚丙烯酰胺凝膠電泳直接分析核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的簡(jiǎn)單、快速、敏感方法。通過(guò)蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核酸探針特異性結(jié)合,電泳時(shí)這種復(fù)合物較無(wú)蛋白結(jié)合的探針在凝膠中的泳動(dòng)速度要慢,即表現(xiàn)為相對(duì)滯后。47 、細(xì)胞的破碎方法機(jī)械法 ：液體剪切法與固體剪切法本法不適合于染色體 DNA 的分離與純化非機(jī)械法 ：干燥法與溶胞法溶胞法溫和，能保證較高的得率與較好地保持核酸的完整性而得到廣泛的應(yīng)用48 、核酸的分離與純化應(yīng)去除的污染物主要包括非核酸的大分子污染

12、物非需要的核酸分子在核酸的分離純化過(guò)程中加入的對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用有影響的溶液與試劑49 、核酸濃縮最常用的方法 - 沉淀。其優(yōu)點(diǎn)很容易地調(diào)整核酸溶液至所需濃度，能去 除部分雜質(zhì)與某些鹽離子。50、核酸沉淀的洗滌：用 70%75%的乙醇51、 核酸濃度測(cè)定 紫外分光光度法：適用于>0.25 口 g/的核酸溶液52、熒光光度法：用溴化乙錠（EB）。靈敏度可達(dá)1ng5ng，適合低濃度核酸溶液 的定量分析。 SYBR Gold 作為一種新的超靈敏熒光染料，可檢出 <20pg 的雙鏈 DNA53 、核酸純度鑒定（1） 紫外分光光度法： A260/A280純 DNA 比值為 1.8，純 RNA

13、比值為 2.0。比值升高與降低均表示不純。比值為 1.8 的 DNA 溶液不一定為純的 DNA 溶液一般 28S RNA 的熒光強(qiáng)度約為 18S RNA 的 2 倍，否則提示有 RNA 的降解。如果在加樣槽附近有著色條帶，則說(shuō)明有 DNA 的污染。54 、核酸的保存DNA的保存 DNA溶于TE緩沖液中在-70 C可以儲(chǔ)存數(shù)年。RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L NaAc 溶液或雙蒸水中，在-70 C至-80 C保存。以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA可延長(zhǎng)保存時(shí)間。RNA沉淀溶于70%乙醇或去離 子甲酰胺液中，可在-20 C中長(zhǎng)期保存。55 、基因組 DNA 分離與純化的方法酚抽提

14、法、甲酰胺解聚法 、玻棒纏繞法、其他 DNA 快速提取法56 、裂解緩沖液中各成分的作用：EDTA ：二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制 DNA 酶活性，并降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。SDS ： 陰離子去污劑，可降解細(xì)胞膜、乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使它們沉淀，同時(shí)降解DNA 酶。無(wú) DNA 酶的 RNA 酶：可有效水解 RNA 而避免 DNA 的消化蛋白酶K :水解蛋白質(zhì)，可消化 DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。酚： 可使蛋白變性沉淀、抑制 DNA 酶活性。pH8.0 的 Tris 溶液： 能保證抽提后 DNA 進(jìn)入水相，而避免滯留于蛋白質(zhì)層。57 、甲酰胺是一種離子化溶劑 , 其作用：裂解蛋白質(zhì)與 DNA 的復(fù)合物、

15、使釋放的蛋白質(zhì)變性、對(duì)蛋白酶K 的活性無(wú)顯著影響58 、玻璃纏繞法得到的DNA 用途： 構(gòu)建基因組 DNA 文庫(kù)、 Southern 印跡、 PCR 擴(kuò)59 、從瓊脂糖凝膠中回收 DNA 片段DEAE 纖維素膜插片電泳法 操作簡(jiǎn)單、對(duì)小于 5kb 片段回收率好、回收 DNA 純度 高、但不能回收單鏈 DNA 、不適于大于 15kb 的 DNA 片段回收。電泳洗脫法 液氮冷凍擠壓法 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠塊回收法 商品試劑盒 （ 柱層析）60 、從聚丙烯酰胺凝膠中回收 DNA 片段標(biāo)準(zhǔn)方法： 壓碎與浸泡法本法能很好地回收v 1kb的單鏈或雙鏈DNA61 、堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 基本原理： pH12

16、.6 高堿性條件下，染色體 DNA 和質(zhì) 粒 DNA 都變性，但質(zhì)粒 DNA 超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)以 pH4.8 的 KAc 高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH 至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒 DNA 又恢復(fù)到原來(lái) 構(gòu)型，保存在溶液中。 染色體 DNA 不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心，染 色體DNA與不穩(wěn)定的大分子 RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。62 、質(zhì)粒純化： CsCl-EB 等密度梯度超速離心法 （標(biāo)準(zhǔn)方法 ）63 、聚乙二醇 （PEG） 沉淀法優(yōu)點(diǎn) :簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、適用廣泛，尤其對(duì)堿裂解法提取質(zhì)粒的純化效果好.適用: 分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)、高

17、效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。缺點(diǎn): 不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 與閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 。64、總 RNA 的分離與純化： （異）硫氰酸胍 -酚氯仿法總 RNA 提取法中最常使用的是一步法。（異）硫氰酸胍 -酚氯仿法是經(jīng)典的一步法65、同時(shí)制備 RNA 、 DNA 與蛋白質(zhì)的一步法： 是（異）硫氰酸胍 -酚氯仿一步法的改進(jìn) 方法。 （異）硫氰酸胍 -酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的DNA 與蛋白質(zhì)位于兩相的界面。上層水相 -RNA ：通過(guò)異丙醇沉淀與 75%乙醇洗滌 而獲得。可用于 mRNA 的純化、 Northern 雜交、逆轉(zhuǎn)錄和 RT-PCR 反應(yīng)等。處于界 面的

18、 DNA 與蛋白質(zhì)可通過(guò)乙醇和異丙醇分級(jí)沉淀出來(lái)。制備的 DNA: 作 PCR 反應(yīng)模 板，蛋白質(zhì)樣品 : 主要用于免疫印跡。66 、DNA 重組( DNA recombination)不同來(lái)源的 DNA 分子，通過(guò)磷酸二酯鍵連接而重新組合的過(guò)程67 、重組 DNA ：在體外用限制性內(nèi)切酶 ，將不同來(lái)源的 DNA 分子進(jìn)行特異地切割， 獲得的目的基因或 DNA 片段與載體重新連接，從而組成一個(gè)新的 DNA 分子。68 、克隆( clone )由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖以后形成的子代群體。69 、DNA 分子克?。?構(gòu)建 DNA 重組體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞建立無(wú)性繁殖體系70 、基因克隆： 重組的 DNA

19、 分子能夠通過(guò)一定的方式進(jìn)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，在宿主 細(xì)胞中進(jìn)行無(wú)性增殖，獲得大量的目的基因或 DNA 片段的過(guò)程。71 、限制性內(nèi)切酶： 一類核酸水解酶，能識(shí)別和切割雙鏈 DNA 分子中的特定核苷酸 序列, 識(shí)別序列一般具雙重對(duì)稱性 (回文結(jié)構(gòu)) .72 、限制性內(nèi)切酶的主要用途： 改造和組建質(zhì)粒組建基因組 DNA 物理圖譜基因組DNA同源性研究 DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析73 、DNA 連接酶 (DNA ligase) 基因工程的縫紉針催化雙鏈DNA 一端的3 -OH與另一雙鏈DNA5 '端的磷酸根形成3 ','磷酸二酯 鍵，使具有相同粘末端或平端的D

20、NA末端連接起來(lái)。T4噬菌體DNA連接酶-常用大腸桿菌 DNA 連接酶 少用74、 堿性磷酸酶：催化DNA , RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的5 '磷酸基團(tuán)水 解。75、載體(Vector)攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。76 、載體具備的條件 宿主細(xì)胞中有自主復(fù)制能力或能整合到宿主染色體上與基因組一同復(fù)制的能力； 有合適的限制性酶切位點(diǎn)供外源DNA 片段插入 分子量不宜過(guò)大，便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數(shù)，也利于體外重組操作； 具有合適的篩選標(biāo)記，如抗藥性、酶基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型或形成噬菌斑的能力等； 配備與宿主相適應(yīng)的調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子

21、和前導(dǎo)序列等。77 、用作克隆載體的理想質(zhì)粒一般具備的特點(diǎn)：具有松馳型復(fù)制子；復(fù)制子外存在多克隆位點(diǎn)；具有插入失活的篩選標(biāo)記，如 Ampr和Tetr ;分子量相對(duì)較小但有較高的拷貝 數(shù)。78 、噬菌體( Bacteriophage ， phage )是一類細(xì)菌病毒的總稱，即感染細(xì)菌的病 毒。噬菌體嚴(yán)格依賴于細(xì)菌宿主細(xì)胞生長(zhǎng)與繁殖，一旦脫離宿主細(xì)胞，盡管可以生存 但不能生長(zhǎng)與復(fù)制。79 、噬菌粒( phagemid )是一類由質(zhì)粒與單鏈?zhǔn)删w結(jié)合而成的載體。常用的噬菌 粒有 pUC118 /pUC119 和 pTZ19U80、黏粒(cosmid )又稱柯斯質(zhì)粒，是一種以入噬菌體為基礎(chǔ)，專門為克隆

22、大片段而 設(shè)計(jì)、并和質(zhì)粒共同構(gòu)建的雜合載體。黏粒載體具有質(zhì)粒和噬菌體載體的雙重特性； 具有高容量的克隆能力(3145kb );具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。黏粒主 要同于真核細(xì)胞基因組文庫(kù)的構(gòu)建。81、構(gòu)建基因組文庫(kù)多用入噬菌體和黏性質(zhì)粒作為載體；構(gòu)建 CDNA文庫(kù)和克隆較小 DNA 片段常用 pUC 系列質(zhì)粒； M13 噬菌體則用于克隆一些待測(cè)的 DNA 序列。82 、轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 將重組的 DNA 分子引入細(xì)菌 (原核細(xì)胞 ),使其在細(xì)菌 體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過(guò)程83 、轉(zhuǎn)染作用 (transfection) 將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的 DNA 重組體

23、導(dǎo) 入真核細(xì)胞的過(guò)程84、在生長(zhǎng)過(guò)程中只有某一階段的細(xì)菌才能成為轉(zhuǎn)化的接受體，這稱為 感受態(tài) (competent) 細(xì)菌 。細(xì)菌的感受態(tài)可誘導(dǎo)產(chǎn)生，如氯化鈣法就可誘導(dǎo)細(xì)菌成為感受 態(tài)。感受態(tài)細(xì)菌表面其正電荷增加，細(xì)胞壁和膜通透性增加，有利于DNA 分子吸附與吸收 .85 、 PCR 技術(shù)的基本原理： 在合適的緩沖體系中 ,通過(guò)加熱使模板 DNA 雙鏈中的氫鍵斷裂形成單鏈，這個(gè)過(guò)程稱為變性。在合適的溫度條件下，特異性引物與模板DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，這個(gè)過(guò)程稱為退火。在 DNA 聚合酶的作用下，引物 延伸，形成新的 DNA 鏈。如此循環(huán)往復(fù)，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后，模板 DNA 在 2 個(gè)特

24、異性 引物之間的序列就會(huì)大量擴(kuò)增。86 、 PCR 技術(shù)的特點(diǎn)： 高度的靈敏性、特異性、操作簡(jiǎn)便易行、用途廣泛87 、PCR 反應(yīng)體系的影響因素 :DNA 模板、引物、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、緩沖 液、熱循環(huán)參數(shù)88 、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析：Gel electrophoresis 、 Restriction endonuclease、Single strand conformationpolymorphism(SSCP)、 Nucleic acid sequence 、 Molecular hybridization89、熒光定量PCR :通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性

25、的探針 ，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 跟蹤 ,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程 ,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析 ,計(jì)算待測(cè)樣品的初始 模板量90 、基線: 是擴(kuò)張曲線的水平部分91 、 CT 值: 從基線到指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)92 、絕對(duì)定量: 用于確定未知樣品中某個(gè)核酸序列的絕對(duì)量值，即通常說(shuō)的拷貝數(shù)。93 、相對(duì)定量: 用于測(cè)定一個(gè)測(cè)試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的 相對(duì)變化94 、熒光定量實(shí)時(shí) PCR 與普通 PCR 的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 :對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加 ,直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性:使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異

26、性結(jié)合,提高了 PCR 反應(yīng)的特異性增加定量的精確性:全程監(jiān)控 ,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便 ,無(wú)需跑膠95、 PCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變：是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段 ，然后用人工 合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交96、 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部批準(zhǔn)項(xiàng)目:二級(jí)醫(yī)院以上 HBV 、 HCV、 TB、 CT、 HIV 、 HLA97、 標(biāo)準(zhǔn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須包括四個(gè)工作區(qū)域(working zones) :試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) 四區(qū)須互相獨(dú)立，并嚴(yán)格按照上述順序設(shè)置，并遵循單一走向的工作區(qū)域。98 、環(huán)境污染處理 (Cont

27、amination around circumstances)稀酸或消毒液處理法、紫外線照射法99、反應(yīng)液污染的處理： 在PCR反應(yīng)液（不含Taq DNA 聚合酶和模板）中加入0.5uDNase I 或核酸內(nèi)切酶（如 10u 的 Msp I ），室溫下 30-60 分鐘。加熱滅活DNase I 或核酸內(nèi)切酶，再加入 Taq DNA 聚合酶和模板做 PCR100 、 變性（ denaturation ）在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)， 形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。101 、 變性核酸的特點(diǎn)： 粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加102、融解溫度（Tm）在DNA熱變

28、性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度103 、 影響 Tm 的因素： DNA 堿基的組成、溶液的離子強(qiáng)度、 pH 值、變性劑104 、 復(fù)性： 變性 DNA 經(jīng)過(guò)一定處理重新形成雙螺旋的過(guò)程。105 、 影響復(fù)性速度的因素： DNA 濃度、 DNA 片段的大小、 DNA 片段復(fù)雜性、合適的復(fù)性溫度、適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度106 、 雜交： 兩條來(lái)源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè) 雜交體，這個(gè)過(guò)程即雜交，或稱分子雜交。107 、 探針（ probe ） 指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測(cè) 的分子。108 、 基因探針： 指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)

29、雜交，雜交后又能被特殊方法 檢測(cè)的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈。109 、各類探針特點(diǎn)：基因組DNA探針：無(wú)性繁殖、制備方法簡(jiǎn)單；不易降解（與 RNA比較）；標(biāo) 記方法成熟。cDNA 探針 （complementary DNA ）：不含內(nèi)含子及高度重復(fù)序列但不易獲得RNA 探針： 雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性，雜交較少,未雜交探針可用 RNase降解，減少本底的干擾。易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜寡核苷酸探針：可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列；探針短，序列復(fù)雜性低，分子量小，因此雜交時(shí)間短 ; 長(zhǎng) 度只有 1050bp ，該識(shí)別序列內(nèi) 1 個(gè)堿基的變化可明顯降低雜交Tm值?？纱罅亢铣桑瑑r(jià)格低，能

30、夠用酶學(xué)或化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記。110 、理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具備：高度的敏感性標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時(shí)堿基配對(duì)及探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì)；檢測(cè)方法除有高靈敏性、高特異性、假陽(yáng)性綠低外，尚需考慮環(huán)境污染 少，價(jià)格低；若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)酶的Km值影響不大，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性。111 、放射性核素標(biāo)志物優(yōu)點(diǎn)：可準(zhǔn)確定量，靈敏度高可檢測(cè)固相介質(zhì)上 10fg(10-15g) 的 DNA ；本底低，易 除去舊探針重新雜交新探針；特異性高 , 對(duì)雜交無(wú)影響缺點(diǎn)：短半衰期的探針要求臨時(shí)制備 , 隨用隨標(biāo)、放射性遞減使探針降解、放射性對(duì)人 體有害 ,需防護(hù)、費(fèi)用貴112 、非放

31、射性標(biāo)記 優(yōu)點(diǎn)：無(wú)放射性，對(duì)人體的危害??；探針性質(zhì)穩(wěn)定，可供長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)使用；檢測(cè)過(guò) 程快，可同時(shí)進(jìn)行不同標(biāo)記探針的雜交；本底較低缺點(diǎn)：靈敏度和特異性不如放射性探針，雜交條件受到報(bào)告基團(tuán)的限制，重新雜交新 探針較困難113、 直接放射自顯影： 在暗室中將含放射性的濾膜與 X 線膠片緊密的貼在一起，放 入不透光的盒子 .114 、 間接放射自顯影 為增加 32P 檢測(cè)敏感性， X 線膠片被夾在增感屏和濾膜之 間，增感屏是一種有彈性的塑料片，由閃爍物如鎢酸鈣覆蓋，這種物質(zhì)在受到激發(fā)時(shí) 可發(fā)光 .115、 化學(xué)發(fā)光 是指化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量以光的形式發(fā)射出來(lái)116 、 液相雜交： 一種研究最早且操作

32、簡(jiǎn)便的雜交類型，應(yīng)用較少117 、 Southern 印跡雜交： 是一種使凝膠中的 DNA 轉(zhuǎn)移到載體膜上的方法。118、Northern 印跡雜交：將RNA樣品變性和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn) 移到 NC 膜等固相載體上，用標(biāo)記的 DNA 或 RNA 特異探針對(duì)固定在膜上的 RNA 進(jìn) 行雜交。119 、 Southern 印跡雜交與 Northern 印跡雜交的異同：同：基本原理異：變性方法(N:聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞；S:堿變性)120、點(diǎn)雜交(dot blot)/狹縫雜交(slot blot):將少量 RNA樣品點(diǎn)在 Dot和Slot雜交濾器中的 NC 膜上，濾膜

33、干燥后用 32P 標(biāo)記的 RNA 或 DNA 探針進(jìn)行雜交和用 X 線片進(jìn)行放射性自顯影。較 Northern blot 省去了電泳和毛細(xì)轉(zhuǎn)膜過(guò)程121 、 點(diǎn)/狹縫雜交方法學(xué)評(píng)價(jià): 僅需少量樣品、不需電泳與轉(zhuǎn)膜過(guò)程，方法快捷、適 用于同時(shí)分析多個(gè)樣品，方便雜交條件的摸索。不能檢出基因的大小或重復(fù)的程度。 本法是快速確定目標(biāo)基因是否存在的檢測(cè)方法。122 、 原位雜交( in situ hybridization )應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中的核酸按堿 基配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯 微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)。123、 生物芯片: 將

34、大量生物分子探針( DNA 、蛋白質(zhì))固定于支持物上后與帶熒光 標(biāo)記的 DNA 樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣 品分子的數(shù)量和序列信息。124 、 1992 對(duì)原位合成制備的 DNA 芯片作了首次報(bào)道，這是世界上第一塊基因芯 片。 1 996 年創(chuàng)造了世界上第一塊商業(yè)化的生物芯片。125 、 生物芯片的特點(diǎn): 高通量、集成化、并行化、微型化126 、生物芯片可以分為哪些？微陣列芯片 microarray : 基于生物分子間的親和作用基因芯片( cDNA 或寡核苷酸)；蛋白質(zhì)芯片； 細(xì)胞芯片；組織芯片；微流體芯片 microfluid : 基于各種微結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電泳

35、芯片； PCR 反應(yīng)芯片；介電電泳芯片微縮芯片實(shí)驗(yàn)室 lab-on-a-chip127、基因芯片(gene chip) 又稱 DNA 芯片(DNA chip) 或 DNA 微陣列(DNA microarray) 。將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為 基因芯片。128 、 基因芯片技術(shù)步驟: 芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)、結(jié)果分析。129 、 探針在載體表面的固定方法:原位合成(即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針)，適用于寡核苷酸；合成后點(diǎn)樣，多用于大片段 DNA ，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚 至 mRNA 。130 、雜交反應(yīng) 是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的

36、探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過(guò) 程。131 、 蛋白質(zhì)芯片( protein chip )，又稱蛋白質(zhì)微陣列 (protein microarray) ，是用 于蛋白質(zhì)功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機(jī)械點(diǎn)樣或共價(jià)結(jié)合 的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍 膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。132 、蛋白芯片的原理： 在待分析樣品中的生物分子與蛋白質(zhì)芯片的探針?lè)肿影l(fā)生雜 交或相互作用后，利用激光共聚焦顯微掃描儀對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行高通量檢測(cè)和分析，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽、蛋白質(zhì)及其他生物成份進(jìn)行高通量檢測(cè)。133 、芯片實(shí)驗(yàn)室 是將樣品制備、生化反應(yīng)

37、和檢測(cè)分析的全過(guò)程集約化，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)(micro total an alysis syste n,(i-TAS)，或稱“縮微芯片實(shí)驗(yàn)室” (lab-on-a-chip )。134、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)： 分析全過(guò)程自動(dòng)化、生產(chǎn)成本低、防污染、分析速度 快、所需樣品少、極高的樣品并行處理能力、體積小、重量輕、便于攜帶。135 、復(fù)雜性疾?。?發(fā)病原因不完全明了，由多個(gè)基因和環(huán)境因素共同參與，不符合 孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，不僅在特定家系發(fā)病率高，而且對(duì)群體影響大，經(jīng)過(guò)多個(gè)階段才出 現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)典型臨床表現(xiàn)時(shí)往往已處于病程中后期，多數(shù)已失去最佳治療時(shí)期，此類 疾病成為

38、 。136 、分子診斷： 以 DNA 和 RNA 為主要診斷材料，通過(guò)檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)功能 的異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。137 、復(fù)雜性疾病分子診斷的特點(diǎn)直接檢測(cè)疾病相關(guān)基因，屬病因診斷，針對(duì)性強(qiáng)特異性強(qiáng)、靈敏度高：分子雜交、PCR、生物芯片、質(zhì)譜等技術(shù)適用范圍廣：遺傳疾病、腫瘤、感染、心血管等疾病138、 血漿 DNA (plasma DNA ) 又稱循環(huán) DNA ( circulating DNA ) ，是一種無(wú)細(xì) 胞狀態(tài)的細(xì)胞外 DNA (extra cellular DNA) ，由長(zhǎng)度不等的單鏈或雙鏈 DNA 及其混 合物組成，主要以 DNA- 蛋白質(zhì)混合物形式存

39、在，但也存在部分游離 DNA 。139 、 斑點(diǎn)雜交 :將待測(cè)的 DNA 變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上，用已標(biāo) 記的探針進(jìn)行雜交，洗膜 (除去未接合的探針 )，放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交 強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)。140 、 ASO 為一種以雜交為基礎(chǔ)對(duì)已知突變的檢測(cè)技術(shù)。設(shè)計(jì)一段 19bp 左右的寡核 苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，經(jīng)標(biāo)記后作為探針，與固定在膜上的樣品 DNA 雜交。同時(shí)以野生型探針（無(wú)突變）為對(duì)照，如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交帶，則表明樣品中 存在與該 ASO 探針相應(yīng)的點(diǎn)突變。用于已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙 酮尿癥、某些癌基因、抑癌

40、基因點(diǎn)突變。141 、PCR-SSCP ，利用 PCR 從提取出的 DNA 中擴(kuò)增目標(biāo)基因，用外切核酸酶消化 掉一條鏈，相同長(zhǎng)度的單鏈 DNA 因序列，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同， 在非變性凝膠中的遷移率不同，標(biāo)記后可顯影觀察。用于點(diǎn)突變的遺傳疾病，苯丙酮 尿癥、某些癌基因、抑癌基因點(diǎn)突變。142 、RFLP ，檢測(cè) DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小。凡是 可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段 DNA 的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP 的產(chǎn)生。143 、簡(jiǎn)述腫瘤的發(fā)病機(jī)制？階梯式遺傳性疾病、基

41、因變異 、表觀遺傳學(xué)改變 、DNA 損傷及其分子改變腫瘤基因組的不穩(wěn)定性 、腫瘤中染色體的異常 、腫瘤中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性144 、癌基因分類： 生長(zhǎng)因子類；酪氨酸激酶類； GTP 結(jié)合蛋白類；核蛋白類；端粒 酶。145 、癌基因的活化機(jī)制： 轉(zhuǎn)導(dǎo)；點(diǎn)突變；插入突變；易位；基因擴(kuò)增；基因甲基化 改變。146 、 常見(jiàn)的抑癌基因： Rb 基因； p53 基因； APC 基因147 、腫瘤分子診斷需考慮的因素： 特殊類型腫瘤的靶基因 不同腫瘤特定靶基因 的突變譜 供檢測(cè)使用的合適臨床樣本 分子診斷技術(shù)的敏感性148 、肺癌相關(guān)基因改變： 基因點(diǎn)突變檢測(cè)： K-ras 基因和 p53 基因抑癌基因啟動(dòng)

42、子甲基化檢測(cè)： APC 基因149 、目前最常用的甲基化檢測(cè)技術(shù)： 甲基化特異性引物基因擴(kuò)增（ MSP）甲基化特異性序列分析（ MSS ）150 、 結(jié)腸直腸癌早期分子診斷： 癌基因 K-ras 和抑癌基因 APC 的突變發(fā)生在早期。糞便中 K-ras 突變檢測(cè)，但糞便中 K-ras 突變并非全是腸源性。 CD44 與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移 有關(guān)。151、乳腺癌早期分子診斷：90%家族性乳腺癌涉及 BRCA1和BRCA2基因突變。152 、 原發(fā)胰腺癌早期分子診斷： p53 和 CD44153、 胰腺癌早期分子診斷 ： 72 % -100% 的原發(fā)性胰腺腺癌發(fā)生 K-ras 基因突變154 、 腫瘤微小殘

43、留?。?腫瘤患者原發(fā)病灶去除后，體內(nèi)仍存在來(lái)自原發(fā)病灶的腫瘤 細(xì)胞，以單個(gè)腫瘤細(xì)胞或肉眼不可見(jiàn)細(xì)胞集落的形式存于腫瘤患者血液或組織中。微 小殘留病是腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因，其分子診斷對(duì)病人的治療和預(yù)后具有重要意義。155 、 原發(fā)性高血壓的定義： 又稱高血壓病，是指收縮壓或舒張壓升高臨床綜合征。(1)確診高血壓 指收縮壓160mmHg 和/或舒張壓95mmHg ，兩者有一項(xiàng)經(jīng)核實(shí) 即可確診。 臨界高血壓 指收縮壓140mmHg 但v 160mmHg 和(或)舒張壓90mmHg 但v 95mmHg 。156、 原發(fā)性高血壓的分子遺傳：腎素基因、血管緊張素原基因、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE )基因、心鈉

44、素基因157、 HLA class Ian tige ns (A, B & C)將內(nèi)源性多肽遞呈給 CD8陽(yáng)性毒性T細(xì) 胞。158、 HLA class II antigens將外源性抗原肽遞呈給 CD4陽(yáng)性T細(xì)胞159 、 HLA 的遺傳特點(diǎn)： 單倍型遺傳、共顯性遺傳、連鎖不平衡160 、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP) 是最早應(yīng)用于 HLA 基因分型的方法。161 、序列特異性寡核苷酸探針技術(shù) (SSOP) 根據(jù)固定在雜交膜上的是 PCR 產(chǎn)物或特異 性探針而將其區(qū)分為正向 SSOP和反向SSOP。反向雜交技術(shù)是將一套設(shè)計(jì)合理的探 針固定于雜交膜上，再與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，因其一次雜交即可檢測(cè)所有等位基因，大大 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，從而被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室接受。162、PCR-序列特異性引物(SSP)用作臨床常規(guī)分型方法163 、 FCM 技術(shù)可定性也可定量，而且特異、敏感、快速，同其它檢測(cè)技術(shù)比較，其 最獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)是可幾秒鐘內(nèi)同時(shí)檢測(cè)上千個(gè)細(xì)胞，因而該技術(shù)更多地應(yīng)用于批量測(cè) 量。而且流式細(xì)胞術(shù) 無(wú)假陰性和假陽(yáng)性 出現(xiàn)，因此該技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。164、以堿基序列為基礎(chǔ)的 HLA分型(SBT)直接對(duì)HLA的DNA序列進(jìn)行分析比檢測(cè) 其表型更加直觀、可靠、準(zhǔn)確。是鑒定 HLA 等位基因的