實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡使用ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七-1細(xì)胞熒光染色察看與熒光顯微細(xì)胞熒光染色察看與熒光顯微鏡的運(yùn)用鏡的運(yùn)用示范：細(xì)胞形狀察看與暗視示范：細(xì)胞形狀察看與暗視野顯微鏡的運(yùn)用野顯微鏡的運(yùn)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c教學(xué)要求實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c教學(xué)要求n掌握熒光顯微鏡的成像根本原理及掌握熒光顯微鏡的成像根本原理及其運(yùn)用；其運(yùn)用；n掌握暗視野顯微鏡的成像根本原理掌握暗視野顯微鏡的成像根本原理及其運(yùn)用。及其運(yùn)用。熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其根本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)展激根本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)展激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用

2、于對樣品構(gòu)造或其組分進(jìn)展定性、定位、定量察看檢測。構(gòu)造或其組分進(jìn)展定性、定位、定量察看檢測。一、熒光顯微鏡的成像原理一、熒光顯微鏡的成像原理什么是熒光什么是熒光 ? ?n物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能形狀物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能形狀轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣苄螤睿倩氐降湍苄螤顣r釋轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣苄螤?，再回到低能形狀時釋放出的光。放出的光。n即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。堅(jiān)持固有的熒光特性堅(jiān)持固有的熒光特性熒光波長激發(fā)波長熒光波長激發(fā)波長熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒

3、光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)熒光的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：檢出才干高檢出才干高對細(xì)胞的刺激小對細(xì)胞的刺激小能進(jìn)展多重染色能進(jìn)展多重染色用途：用途：物體構(gòu)造的察看物體構(gòu)造的察看熒光的有無、顏色比較進(jìn)展物質(zhì)判別熒光的有無、顏色比較進(jìn)展物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光素?zé)晒馑丶ぐl(fā)波長激發(fā)波長 發(fā)射波長發(fā)射波長DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange49049

4、0590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615對細(xì)胞構(gòu)造或組分的定性、定位、半對細(xì)胞構(gòu)造或組分的定性、定位、半定量研討。定量研討。作為生物大分子挑選與鑒定的標(biāo)志物。作為生物大分子挑選與鑒定的標(biāo)志物。熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研討中的運(yùn)用熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研討中的運(yùn)用二、暗視野顯微鏡的成像原理二、暗視野顯微鏡的成像原理經(jīng)過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改經(jīng)過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改動途徑，不直接進(jìn)入物鏡，而是傾斜地照動途徑，不直接進(jìn)入物鏡，而是

5、傾斜地照射到樣品上，由樣品外表的繞射光線入射射到樣品上，由樣品外表的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。三、試劑與器材三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片HE染色染色甲醇、甲醇、1 丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟蛙血細(xì)胞染色察看：取少許蛙血蛙血細(xì)胞染色察看：取少許蛙血 常規(guī)血涂片常規(guī)血涂片 涼干涼干 甲醇固定甲醇固定10 min 1 丫啶橙染色丫啶橙

6、染色5 min 水洗水洗 室室溫枯燥濾紙擦干玻片底面溫枯燥濾紙擦干玻片底面 熒光顯微鏡察看先低倍熒光顯微鏡察看先低倍后高倍察看后高倍察看 可在同一玻片上察看未熒光染色的血細(xì)胞可在同一玻片上察看未熒光染色的血細(xì)胞取洋蔥取洋蔥撕取一小片內(nèi)表皮撕取一小片內(nèi)表皮平面單層鋪展于玻片上平面單層鋪展于玻片上室溫室溫涼干涼干1丫啶橙染色丫啶橙染色5min 水洗用吸管，小心掉片水洗用吸管，小心掉片 室溫枯燥或用濾紙擦干室溫枯燥或用濾紙擦干 熒光顯微鏡察看熒光顯微鏡察看暗視野顯微鏡察看蛙血細(xì)胞示范暗視野顯微鏡察看蛙血細(xì)胞示范察看人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片察看人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片HE染色染色n 熒

7、光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下察熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下察看?？?。n 運(yùn)用熒光顯微鏡時要留意不要直接察看運(yùn)用熒光顯微鏡時要留意不要直接察看激發(fā)光源，維護(hù)眼睛。激發(fā)光源，維護(hù)眼睛。n 暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下察看。察看。 五、本卷須知五、本卷須知六、作業(yè)與思索題：六、作業(yè)與思索題：描畫在熒光顯微鏡下所察看到描畫在熒光顯微鏡下所察看到的實(shí)驗(yàn)景象。的實(shí)驗(yàn)景象。繪圖比較人正常肝組織細(xì)胞和繪圖比較人正常肝組織細(xì)胞和脂肪肝組織細(xì)胞。脂肪肝組織細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七-2 激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的運(yùn)用運(yùn)用 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要

8、求實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1. 掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像根本掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像根本原理及其在生命科學(xué)中的運(yùn)用。原理及其在生命科學(xué)中的運(yùn)用。Laser Scanning Confocal Microscope普通熒光顯微鏡的缺乏普通熒光顯微鏡的缺乏 運(yùn)用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定成分或構(gòu)造，運(yùn)用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定成分或構(gòu)造，不僅圖像與對比度加強(qiáng)，而且由于許多熒光顯不僅圖像與對比度加強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源運(yùn)用短波長的紫外光，大大提高了微鏡的光源運(yùn)用短波長的紫外光，大大提高了分辯率分辯率=0.61 / NA 。但當(dāng)所察看的熒光標(biāo)。但當(dāng)所察看的熒光標(biāo)本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接

9、納焦平面上本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接納焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接納，這些來自焦平面以外的熒光光也被物鏡接納，這些來自焦平面以外的熒光使察看到的圖像反差和分辨率大大降低即焦使察看到的圖像反差和分辨率大大降低即焦平面以外的熒光構(gòu)造模糊、發(fā)虛，緣由是大多平面以外的熒光構(gòu)造模糊、發(fā)虛，緣由是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊構(gòu)造。數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊構(gòu)造。一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像根本原理一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像根本原理2. 共聚焦掃描顯微鏡的成像原理共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上構(gòu)

10、成一個輪廓清采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上構(gòu)成一個輪廓清楚的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜楚的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于；相對于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)經(jīng)過一系焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)經(jīng)過一系列的透鏡，最終可同

11、時聚焦于照明針孔和探測針孔。列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測測孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成明晰的整個焦平面的共聚焦圖像。聚合成明晰的整個焦平面的共聚焦圖像。Confoca

12、l Principle每一幅焦平面圖像實(shí)踐上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，每一幅焦平面圖像實(shí)踐上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，構(gòu)成待察看樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)層掃描，構(gòu)成待察看樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把切片。把X-Y平面焦平面掃描與平面焦平面掃描與Z軸光軸軸光軸

13、掃描相結(jié)合，經(jīng)過累加延續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)掃描相結(jié)合，經(jīng)過累加延續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處置，可以獲得樣品的三維過專門的計(jì)算機(jī)軟件處置，可以獲得樣品的三維圖像。圖像。察看方式：以熒光為主察看方式：以熒光為主光源：激光紫外、可見光、近紅外光源：激光紫外、可見光、近紅外照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時觀測輸出：實(shí)時觀測,數(shù)字化圖像，可以進(jìn)展圖像處置和定量分析數(shù)字化圖像，可以進(jìn)展圖像處置和定量分析多重染色樣品的察看多重染色樣品的察看LSCM的根本特點(diǎn)3. 共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研討中的運(yùn)用共聚焦掃描顯

14、微鏡在生命科學(xué)研討中的運(yùn)用細(xì)胞構(gòu)造、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞構(gòu)造、蛋白質(zhì)如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物、骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物、DNA、RNA等等細(xì)胞膜流動性熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)細(xì)胞膜流動性熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)氧自在基活性細(xì)胞內(nèi)氧自在基活性細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化膜電位膜電位三、試劑與器材三、試劑與器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 DAPI 、甘油、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟取涂有細(xì)胞的載玻片細(xì)胞涂在中間，冷丙取涂有細(xì)胞的載玻片細(xì)胞涂在中間，冷丙酮酮40C固定固定10 min;PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室溫孵育室溫孵育30 min; PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片劑封片劑(pH8.5，PBS:甘油甘油=1:9，v/v)封片封片