14基因工程菌的發(fā)酵-基因工程菌的發(fā)酵

1、第十三章基因工程菌的發(fā)醉近年來,重組DN徽術(shù)(基因工程)已開始由實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)生產(chǎn),走向?qū)嵱? 它不僅為我們提供了一種極為有效的菌種改進(jìn)技術(shù)和手段,也為攻克醫(yī)學(xué)上的疑難 雜癥一一癌、遺傳病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；為農(nóng)業(yè)的第三 次革命提供了根底；為深入探索生命的奧秘提供了有力的手段.現(xiàn)在由工程菌產(chǎn)生 的珍稀藥物,如胰島素、干擾素、人生長(zhǎng)激素、乙肝外表抗原等等部已先后面市, 基因工程不僅保證了這些藥物的來源,而且可使本錢大大下降.但是從許多研究中 發(fā)現(xiàn),工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,因而工程菌不穩(wěn)定 性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術(shù)成就轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)

2、力的關(guān)鍵之第一節(jié)工程菌的來源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程(genetic engineering )是指在基因水平上,采用與工程設(shè)計(jì)十分 類似的方法,根據(jù)人們的意愿,主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合,再 轉(zhuǎn)入生物體內(nèi),產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物,或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型, 并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代.基因工程的核心技術(shù)是DNA勺重組技術(shù).重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人 工合成的基因,經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組 DNA子,然后在將重組 DNA子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物,該 種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀.

3、除DNA1組技術(shù)外,基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù),基因的突變技術(shù),基因的導(dǎo)入技術(shù) 等.基因工程一般分為4個(gè)步驟：一是取得符合人們要求的DNAt段,這種DNNt段被稱為“目的基因；二是 將目的基因與質(zhì)?；虿《?DNAS接成重組DNA;三是把重組DN聞|入某種細(xì)胞；四 是把目的基因能表達(dá)的受體細(xì)胞挑選出來.DNA分子很小,其直徑只有20埃,約相當(dāng)于五百萬(wàn)分之一厘米,在它們身上進(jìn)行“手術(shù)是非常困難的,因此基因工程 實(shí)際上是一種“超級(jí)顯微工程,對(duì)DNA的切割、縫合與轉(zhuǎn)運(yùn),必須有特殊的工具. 要把目的基因從供體DNA長(zhǎng)鏈中準(zhǔn)確地剪切下來,可不是一件容易的事.1968年,沃納阿爾伯博士、丹尼爾內(nèi)森斯博士

4、和漢密爾史密斯博士第一次從大腸桿菌 中提取出了限制性內(nèi)切酶,它能夠在 DNAk尋找特定的“切點(diǎn),認(rèn)準(zhǔn)后將 DN吩子的雙鏈交錯(cuò)地切斷.人們把這種限制性內(nèi)切酶稱為“分子剪刀.這種“分子剪 刀可以完整地切下個(gè)別基因.自70年代以來,人們已經(jīng)別離提取了 400多種“分 子剪刀.有了形形色色的“分子剪刀,人們就可以隨心所欲地進(jìn)行DN6子長(zhǎng)鏈的切割了.DNA的分子鏈被切開后,還得縫接起來以完成基因的拼接.1976年,科學(xué)們?cè)?個(gè)實(shí)驗(yàn)室里幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)并提取出一種酶,這種酶可以將兩個(gè)DNA片段連接起來,修復(fù)好DNAg的斷裂口.1974年以后,科學(xué)界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn), 并把這種酶叫作DNA!接酶.從此,DNA

5、!接酶就成了名符其實(shí)的“縫合基因的“分子針線.只要在用同一種“分子剪刀剪切的兩種 DNA碎片中加上“分子針 線,就會(huì)把兩種DNAt段重新連接起來.把“拼接好的DNA分子運(yùn)送到受體細(xì) 胞中去,必須尋找一種分子小、能自由進(jìn)出細(xì)胞,而且在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體.理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒,由于質(zhì)粒能自由進(jìn)出細(xì)菌細(xì)胞,應(yīng) 當(dāng)用“分子剪刀把它切開,再給它安裝上一段外來的DNA片段后,它依然如故地 能自我復(fù)制.有了限制性內(nèi)切酶、連接酶及運(yùn)載體,進(jìn)行基因工程就可以如愿以償 了.運(yùn)載體將目的基因運(yùn)到受體細(xì)胞是基因工程的最后一步,目的基因的導(dǎo)入過程 是肉眼看不到的.因此,要知道導(dǎo)入是否成功,事先應(yīng)

6、找到特定的標(biāo)志.例如我們 用一種經(jīng)過改造的抗四環(huán)素質(zhì)粒 PSC100乍載體,將一種基因移入自身無抗性的大腸 桿菌時(shí),如果基因移入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死,就說明轉(zhuǎn)入獲得成功了.二、工程菌的獲得1,確定目的產(chǎn)物.2,找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞.3,將細(xì)胞破碎后提純出全部信使 RNA這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有 蛋白質(zhì)的合成信息.4,利用基因擴(kuò)增技術(shù)PCR,找出所需的目的基因.5,將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體,形成了重組DN的子.6,將重組后DN的子引入到受體細(xì)胞內(nèi),然后選擇適宜的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖. 根據(jù)選擇性標(biāo)記,從菌落中篩選出目的基因的重組 工程菌.三、工程菌應(yīng)具備的條件1,發(fā)酵產(chǎn)品是高

7、濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的,同時(shí)是分泌型菌株2,菌株能利用常用的碳源,并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵.3,菌株不是致病株,也不產(chǎn)內(nèi)毒素.4,代謝限制容易進(jìn)行.5,能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA組,并且穩(wěn)定,重組的 DNA易脫落四、工程菌的應(yīng)用1,基因藥物例如,紅細(xì)胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長(zhǎng)激素和粒細(xì)胞巨噬細(xì) 胞集落刺激因子等.2,其它發(fā)酵產(chǎn)品例如酶制劑、氨基酸蘇氨酸、色氨酸、抗生素等.第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng)就生產(chǎn)流程而言,從發(fā)酵到別離、純化目標(biāo)產(chǎn)物,工程菌和常規(guī)微生物并無太 多的差異.但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,以及平安性 等問題,使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn).一、平安問題關(guān)于

8、基因工程的社會(huì)問題,必須提到它的潛在危險(xiǎn)性.經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一 且用于,工業(yè)化生產(chǎn),就不可預(yù)防地進(jìn)入自然界.這些菌能間接地危害人體健康, 使治療藥物失去效用,污染環(huán)境等.因此,平安問題是極其重要的.1974 年,提出了 DNA組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問題.后來,美、日等國(guó) 都制定了有關(guān)DNAB組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)那么,即在試管內(nèi)用酶等構(gòu)建異種 DNA勺重組分子, 并用它轉(zhuǎn)入活細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn),以及使用重組體的實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循的規(guī)程.其目的是保證 實(shí)驗(yàn)的平安和推動(dòng)重組DNAK研究.這些準(zhǔn)那么參照了預(yù)防病原微生物污染的舉措, 以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)平安度的評(píng)定,采用物理密封 P1P4和生物學(xué)密封B1和B2兩種 方法.物理

9、密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi),以預(yù)防傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散.實(shí) 驗(yàn)規(guī)模在20L以下時(shí),物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)考前須知組成.密 封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí),數(shù)字越大,密封水平越高.生物學(xué)密封要求用只 有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主,同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體,通過 這樣組合的宿主載體系統(tǒng),可以預(yù)防重組菌向外擴(kuò)散.按密封程度分B1和B2級(jí),B2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格.企業(yè)中進(jìn)行重組菌培養(yǎng)時(shí)的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有 LS-1和LS-2.LS-2相當(dāng)嚴(yán)格,工業(yè)生 產(chǎn)起碼應(yīng)在LS-1的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)下培養(yǎng).LS-1標(biāo)準(zhǔn)要點(diǎn)是：1使用預(yù)防重組菌體外漏, 能在密閉狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)部滅菌的培養(yǎng)裝置；2培

10、養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出；3 使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時(shí),要安裝可收集氣溶膠的平安箱等.設(shè)計(jì)用于基因重組菌 的培養(yǎng)裝置時(shí),不僅要考慮外部雜菌的侵入,還要預(yù)防重組菌的外漏.止匕外,培養(yǎng) 后的菌體別離、破碎等處理也必須在平安柜內(nèi)進(jìn)行,或是采用密閉型的設(shè)備.二、基因工程細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)前已述及,基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程與培養(yǎng)方式與天然細(xì)胞培養(yǎng)過程或方式根本 一致.但亦有其自身持點(diǎn).實(shí)踐說明,基因工程細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)中,產(chǎn)物的產(chǎn)率往 往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低.其原因主要與基因工程細(xì)胞特點(diǎn)有關(guān),首先基因工程細(xì) 胞的生長(zhǎng)速率及表達(dá)率與其所載外源 DNA勺穩(wěn)定性及產(chǎn)物分泌過程有關(guān),其中重組 DNA勺穩(wěn)定性尤為重要,重組DN

11、Aft宿主內(nèi)表達(dá)方式有兩種,其一是游離表達(dá)方式、 其二是結(jié)合表達(dá)方式.因此,基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程,重組DNA勺喪失方式亦有兩種,其一是細(xì)胞培養(yǎng)過程,由于回復(fù)突變或分配作用致使DNAg失.稱為脫落性不穩(wěn)定,其二是重組DNA中編碼的結(jié)構(gòu)基因在宿主內(nèi)發(fā)生再重組過程產(chǎn)生突變,不再 表達(dá)目的產(chǎn)物,此稱加結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定.其次為提升基因工程細(xì)胞表達(dá)效率,需采取 適當(dāng)舉措,提升重組DNAft宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外 分泌.止匕外,基因工程細(xì)胞的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì)如某種氨基酸或維生素等 的缺陷型,有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物.由此, 在培養(yǎng)工程中應(yīng)考慮限制培

12、養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度,同時(shí)采取舉措,消除抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)的代謝物,以保證細(xì)胞正常生長(zhǎng).由此可見,在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過程,除一 般培養(yǎng)條件外,必需考慮基因工程細(xì)胞的自身特點(diǎn),確定最正確培養(yǎng)條件.三、基因工程細(xì)胞的培養(yǎng)前已述及,基因工程細(xì)胞的培養(yǎng)過程與一般需氧細(xì)胞培養(yǎng)根本一致,同時(shí)培養(yǎng) 方式亦無差異,可采用各種分批培養(yǎng)方式,亦可采用連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)及透析 培養(yǎng)等方式.至于影響基因工程細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物量得率與產(chǎn)物量的因素及有關(guān) 參數(shù).亦可參照普通細(xì)胞相應(yīng)培養(yǎng)方式求得.目前關(guān)于動(dòng)植物基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程的研究剛剛起步,有待進(jìn)一步開展.這 里僅對(duì)基因工程菌的營(yíng)養(yǎng)限制、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組質(zhì)?？截悢?shù)的限制

13、及表達(dá)效率作 簡(jiǎn)單討論.1,底物濃度的限制在基因工程茵培養(yǎng)過程,至少要遵循 Pi級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定,因此必需進(jìn)行菌體 的高密度培養(yǎng).普通E. coli培養(yǎng)時(shí)最高干重菌體收率可達(dá)12. 5%,釀酒酵母可 得14.5%,浙枯草桿菌僅可得2%&右.根據(jù)這些結(jié)果采用枯草桿菌不太適宜,除非其具有產(chǎn)物的高效分泌系統(tǒng).從生物平安性考慮,培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突 變株.培養(yǎng)過程細(xì)胞對(duì)維生素需求量甚微,在培養(yǎng)開始即參加必需量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并 無影響,但培養(yǎng)一開始即參加足夠量氨基酸那么可能因氨基酸濃度過大而抑制細(xì)胞生 長(zhǎng).在此情況下,可采取培養(yǎng)過程中,在調(diào)節(jié)pH值同時(shí)補(bǔ)加氨基酸混合物和葡萄糖

14、的方法,以便培養(yǎng)過程葡萄糖及氨基酸濃度的根本恒定,從而實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng),如 E. coli C600株培養(yǎng)時(shí)可獲得6%干菌體.但菌體對(duì)葡萄糖及氨基酸的收率因培養(yǎng) 條件而異,如以葡萄糖及分別用蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸及色氨酸為底物時(shí),那么平 均每克底物所獲干菌體量分別為 0.3、2.5、15、40及40g.按每克干菌體本錢計(jì), 應(yīng)用蘇氨酸本錢最高,故應(yīng)預(yù)防應(yīng)用蘇氨酸缺陷型菌株為宿主,最好選用維生素缺 陷型菌株為宿主.2、質(zhì)粒穩(wěn)定性重組質(zhì)粒上通常載有Apr基因,獲得該類重組質(zhì)粒的基因工程菌在含氨葦青霉素 培養(yǎng)液中可以生長(zhǎng),而非基因工程菌不能生長(zhǎng).但在基因工程菌高密度培養(yǎng)時(shí),外 加的抗生素Ap易于失活,

15、影響培養(yǎng).為此考慮采用抗生素依賴性變異法替代抗生素 添加法.其方法是通過誘變使宿主成為某抗生素依賴性突變株如鏈霉素依賴性Sd.只有在&存在下宿主才能生長(zhǎng),但重組質(zhì)粒上含有 &非依賴性Smid基因,將 重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞后,所獲克隆菌可在不含抗生素培養(yǎng)基中生長(zhǎng),而喪失質(zhì)粒 菌株卻不能生長(zhǎng).此法很有實(shí)用價(jià)值,但缺點(diǎn)是宿主細(xì)胞易產(chǎn)生回復(fù)突變,造成培 養(yǎng)工程復(fù)雜化,產(chǎn)物產(chǎn)率下降.為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性,在此引入質(zhì)粒保持率 Fn的概念,Fn表示分批培養(yǎng)中細(xì)胞分 裂n次后,培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值,即小培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)九一培養(yǎng)液中細(xì)時(shí)敢_ _ X 100%假定在分批培養(yǎng)過程中,細(xì)胞在對(duì)數(shù)生

16、長(zhǎng)期每次分裂時(shí),其質(zhì)粒喪失率為P,那么Fn為：_1 -Q-P匕一不子而式中a -質(zhì)粒喪失菌株與質(zhì)粒保持率菌株卜的比值；n- 細(xì)胞分裂次數(shù)理論上基因工程菌載荷外源性基因,培養(yǎng)過程細(xì)胞大量合成外源性產(chǎn)物,其負(fù)荷大于質(zhì)粒喪失菌株,故基因工程菌株比生長(zhǎng)速率 N通常較質(zhì)拉喪失菌株小,當(dāng)然 亦有變化不大者.根據(jù)以上方程計(jì)算結(jié)果,Fn變化情況如圖7-20所示.0. i_ _ 一 _0510152 至圖7-2Q細(xì)胞分裂次數(shù)勺質(zhì)粒保持率的關(guān)系由圖7-20可知.假定P= 1%當(dāng)a=0時(shí),說明質(zhì)粒喪失菌株不能生長(zhǎng),培養(yǎng) 處于最理想的穩(wěn)定狀態(tài),亦為質(zhì)粒最穩(wěn)定狀態(tài),此時(shí)Fn接近于1.0;但在無選擇壓力下,a值越大,Fn

17、越低,即質(zhì)粒穩(wěn)定性越差.在基因工程細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)方式中,假設(shè)無選擇壓力,迪常不能得到恒定的穩(wěn)定 狀態(tài).而在有選擇壓力下,那么可獲得穩(wěn)定狀態(tài).但是培養(yǎng)基也與質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān), 采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高,在天然培養(yǎng)基中即使無選 擇壓力亦可保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性,因此,用天然培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)是獲得質(zhì)粒穩(wěn)定 性的良好方法.3,表達(dá)效率及質(zhì)?？截悢?shù)限制在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中,表達(dá)效率與質(zhì)粒拷貝數(shù)有關(guān).在質(zhì)粒穩(wěn)定根底上, 應(yīng)盡可能提升細(xì)胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù).在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階 段,采用不同培養(yǎng)溫度到達(dá)提升拷貝數(shù)目的,在前培養(yǎng)階段采用低溫,以減少細(xì)胞 負(fù)荷,此時(shí)拷貝數(shù)較

18、低,而比生長(zhǎng)速率升高,在主培養(yǎng)中途升高溫度,質(zhì)粒拷貝數(shù) 增加,目的基因產(chǎn)量提升.如圖 7-21所示,在25c下,培養(yǎng)含有穿梭質(zhì)粒pCP的 E. coli C600/pCI857至濁度為5.再將培養(yǎng)溫度提升至37 C,那么質(zhì)?？截悢?shù)增加, 基因產(chǎn)物B-內(nèi)酰胺酶活性增加37倍左右,但Fn急劇下降.止匕外,利用 人噬菌體Pl啟動(dòng)子的溫度敏感性,采用二級(jí)連續(xù)培養(yǎng)方式,第1罐于低溫下培養(yǎng)以降低表達(dá)效率,第2罐高溫培養(yǎng),對(duì)提升表達(dá)效率亦是有效的.止匕外,當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)與某些化合物有關(guān)時(shí),亦可采取添加或去除相應(yīng)化合物的 雙階段連續(xù)過濾培養(yǎng)法以提升拷貝數(shù)和表達(dá)效率.如用含有在色氨酸啟動(dòng)子下游接 有B-半乳糖甘酶

19、基因的重組質(zhì)粒pMCT98勺基因工程菌進(jìn)行單級(jí)連續(xù)培養(yǎng),并結(jié)合 0.2 pm孔徑陶瓷過濾器裝置圖7-22,開始培養(yǎng)液含色氨酸,表達(dá)效率低,當(dāng)生長(zhǎng) 濁度到達(dá)10時(shí),進(jìn)行交叉流動(dòng)過濾,且供應(yīng)不含色氨酸料液,結(jié)果如圖7-23所示. 過濾達(dá)15min后培養(yǎng)液中已測(cè)不出色氨酸,表達(dá)效率增加,B-半乳糖甘酶活力劇增.最終濁度達(dá)150相當(dāng)于含6叱細(xì)胞,B半乳糖甘酶約占總蛋白量8%由此可知,在基因工程細(xì)胞培養(yǎng)工程中,需根據(jù)其固有特點(diǎn)和具體情況,采取相應(yīng)舉措、提升質(zhì)粒穩(wěn)定性,增加質(zhì)粒拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)條件優(yōu)化,提升表達(dá)效率5 4 oo65 OM010培養(yǎng)時(shí)間hO 4家青*劉%wo7o5a【蟆也wMms舉族til重

20、位40 o A5030loMmM w 5I? J 昌00E7-21溫度倜節(jié)型質(zhì)粒保持菌株的雙階段培養(yǎng)虛愛為培米溫度由251提升到37T的時(shí)間6圖7-22用陶瓷過濾器進(jìn)行交叉流動(dòng)過濾的培養(yǎng)方式.新鮮培養(yǎng)基；2.泵；3.培養(yǎng)罐；4.流量計(jì);5,陶瓷過濾器；6.液面計(jì)is oezrmr 12XW/B0緡養(yǎng)時(shí)間h圖7-23含色氨酸啟動(dòng)子的質(zhì)粒保持曲的雙粉段培養(yǎng)出線表示遂行過您并供科i不告色氣蛾培芥范的對(duì)同第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)對(duì)于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定,細(xì)胞在分裂時(shí)喪失質(zhì)粒的概率為 p,那么dXdtP)XdX m X m pX dtKs SKs S所以dX m X m X pdX (1 p) m X對(duì)于

21、底物dS 1 dX 1 dXdt Y dt Y dt對(duì)于產(chǎn)物dP dX v尻5 X第四節(jié)培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似.在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的DNA組實(shí)驗(yàn),以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時(shí),當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系 統(tǒng).現(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主,而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長(zhǎng)良好.作為基因重組體的培養(yǎng)裝置,與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別,即不僅 要預(yù)防外部微生物侵入罐內(nèi),還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置. 按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)那么, 可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量 20L以上和20L以下兩種.現(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置,按其滅菌法又可分兩類.一是

22、在高壓滅菌器中進(jìn) 行培養(yǎng)基及培養(yǎng)罐的滅菌,罐本身通常是玻璃制的,容量在10L以下的居多；另一類是20L以上的培養(yǎng)罐,一般為不銹鋼制品,多采用通新鮮蒸氣進(jìn)行滅菌.前者是 可移動(dòng)的臺(tái)式,罐本身不能承受高壓；后者,蒸汽、空氣等供應(yīng)是用固定管道連接 的,一般不能移動(dòng)；這兩類罐要充分考慮不使微生物由罐外進(jìn)入罐內(nèi)的問題,但并 不一定要解決預(yù)防罐內(nèi)微生物的外漏問題.因此,采用高壓滅菌器滅菌的小型培養(yǎng)罐時(shí)應(yīng)在平安柜內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn).但培養(yǎng)罐稍大,該法就難以使用了.、基因重組菌外漏的防范首先應(yīng)了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作.歸納 起來有：1排氣,2機(jī)械密封,3接種,4取樣,5培養(yǎng)后的滅菌通入濕熱

23、 蒸氣,6排液輸至下一工序.針對(duì)這些均應(yīng)采取一些舉措以防菌體外漏. 現(xiàn)分 別說明如下.1 ,排氣排出的氣中含有大量氣溶膠,在劇烈起泡的培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)液呈泡沫狀.它們從 排氣口向外排出,重組菌也容易隨之外漏.以往培養(yǎng)病原菌時(shí)；為預(yù)防菌體外流,采取加藥劑槽的方法,但效果如何尚有 疑問.有人試驗(yàn)證實(shí),排氣中的微生物數(shù)量隨著培養(yǎng)液中菌體濃度和通風(fēng)速度等而 變化.用5L培養(yǎng)罐裝液量2.5L,以攪拌速度400r/min ,通氣速度1: 1VVM, 即2.5L/min換算成罐內(nèi)通氣速度為11cm/min來培養(yǎng)大腸桿菌,發(fā)現(xiàn)每毫升培養(yǎng)液 中含109個(gè)菌體,每小時(shí)有150400個(gè)菌隨氣排出；而培養(yǎng)釀酒酵母時(shí),每小

24、時(shí)從 每毫升含108個(gè)菌體培養(yǎng)液的排氣中檢出3070個(gè).由此可見,雖然培養(yǎng)液中菌體 濃度相差很大,但大腸桿菌和酵母菌仍以幾乎相同程度從排氣中漏出,并不取決于 菌體個(gè)體的大小.再有,提升通氣速度時(shí),單位體積的排氣中,大腸桿菌和酵母菌 菌數(shù)都增加,通氣速度與漏菌數(shù)之間也密切相關(guān).總之,排氣過程中含有相當(dāng)多的 菌.為此,在通用通氣攪拌型培養(yǎng)罐上安裝排氣鼓泡器,以預(yù)防劇烈起泡時(shí)泡沫直 接外溢和外部微生物侵入污染,同時(shí)還能肉眼觀察通氣狀態(tài)等圖11-8.氣體通過 排氣管到鼓泡瓶,再通過膜濾器.進(jìn)而考察了該排氣鼓泡瓶中參加藥劑如2mol/LNaOH勺效果.另外,為了解加熱能否對(duì)排氣滅菌,進(jìn)行了與上述類似的實(shí)

25、驗(yàn).圖11-9的結(jié)果 說明.用電熱器對(duì)排氣進(jìn)行加熱時(shí),在電熱器出口處的排氣溫度被限制在200.C左右.電熱器之后附有冷凝器,旨在使高溫的排氣冷卻,以防膜濾器燒毀.圖11-8和圖11-9的結(jié)果如表11-4所示.表中數(shù)字為培養(yǎng)開始啟12h中在膜濾 器上捕集到的活菌數(shù).結(jié)果說明,排氣僅通過藥劑還不能完全滅菌.使用藥劑時(shí)假設(shè) 能在排氣鼓泡瓶?jī)?nèi)進(jìn)行攪拌、消泡的話,是會(huì)有效果的.用電熱器將排氣加熱至 2000 C時(shí),均末在膜濾器上檢出大腸桿菌和酵母菌.圖11-10是基因重組菌培養(yǎng)裝置中普遍采用的排氣除菌系統(tǒng).為減少培養(yǎng)液的 蒸發(fā)量和降低排氣的相對(duì)濕度.在罐排氣口外安裝冷卻冷凝器,其后才是加熱器, 排氣氣體

26、經(jīng)此加熱至6080 Co相對(duì)濕度降低可預(yù)防濾器上凝結(jié)水汽.除菌濾器與 培養(yǎng)罐空氣入口處的相同.11T才氣咬后瓶 1V81,埔麻iI +培并 2 .屯總冊(cè)*3,度及,應(yīng)珞理5,痔.6*均11排氣中的微生物個(gè)菌種鼓泡瓶堿電熱器大腸桿菌9806110釀酒酵母71400除菌濾器有經(jīng)多孔填料除菌的膜型濾器和深度型濾器.后者主要用于氣體過濾,其 原理與膜濾器不同,無篩網(wǎng)的效果,而是通過靜電吸附、慣性沖撞等作用捕集氣體 中的粒子.無論使用哪種類型的濾器,都應(yīng)對(duì)排氣進(jìn)行去濕處理.使用膜濾器時(shí), 因?yàn)V器外表凝結(jié)水汽,壓力損失驟增,深度型濾器除菌效率也會(huì)因水汽凝結(jié)而下降 膜濾器原來多用于過濾液體,通過流水性濾器的

27、開發(fā),也能應(yīng)用于氣體過濾了.S 11-10掉,除處錄清i,墻舞r2 氣體冷叁.電,4 ,深度S!旗H2 ,機(jī)械密封通氣攪拌培養(yǎng)罐中貫穿罐的攪拌軸須與傳動(dòng)部連接.作為這局部的軸封使用的 是機(jī)械密封,有單機(jī)械密封和雙機(jī)械密封之分.前者由單密封面將罐與外界隔開. 此密封局部因高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生摩擦熱,故需冷卻和潤(rùn)滑.這樣一來,即便正常運(yùn)轉(zhuǎn), 培養(yǎng)液也會(huì)一點(diǎn)一點(diǎn)地滲入密封面,很有可能經(jīng)此流出.同時(shí),滅菌時(shí)的熱膨脹差 也會(huì)使流出量增加.這是培養(yǎng)結(jié)束后滅菌時(shí)最易外漏的所在.還有,機(jī)械密封受使 用壽命所限,在溢漏發(fā)生前就應(yīng)定期更換.所以單機(jī)械密封的培養(yǎng)罐不宜用于基因 重組菌的培養(yǎng).雙機(jī)械密封是用高于罐內(nèi)壓的壓力,

28、將貯存于另一潤(rùn)滑液槽中的無菌水壓入機(jī) 械密封部,用作軸封潤(rùn)滑液.這時(shí),上、下兩局部即使有一局部的密封液滲漏,培 養(yǎng)液也幾乎無外漏危險(xiǎn).但上、下兩方同時(shí)溢漏時(shí),培養(yǎng)液亦有可能外漏了.因此, 問題在于攪拌軸是由罐的上部還是下部通入.從培養(yǎng)裝置的使用優(yōu)點(diǎn)及攪拌軸長(zhǎng)度 等角度看,用下攪拌為好.但假設(shè)考慮培養(yǎng)液外漏的情況,培養(yǎng)基因重組菌時(shí),以用 上部攪拌的雙機(jī)械密封為好.用磁力方法改變攪拌動(dòng)力的傳動(dòng)就不必?fù)?dān)憂機(jī)械密封的外漏了.10L以下的培養(yǎng)裝置以往一直是用磁力進(jìn)行動(dòng)力傳動(dòng)的,但罐一大,會(huì)出現(xiàn)磁力缺乏、軸承磨損 等問題.目前大至90L培養(yǎng)罐,已能用強(qiáng)磁力進(jìn)行動(dòng)力傳動(dòng).現(xiàn)時(shí),基因重組菌的 培養(yǎng)罐仍采用雙機(jī)

29、械密封的上攪拌方式為多,其次用雙機(jī)械密封的下攪拌方式.3 ,取樣普通培養(yǎng)罐的取樣管道在取樣時(shí)會(huì)流出樣品.取樣后對(duì)樣品管道滅菌時(shí),未滅 菌的培養(yǎng)液污水被排至排水管內(nèi). 對(duì)此,必須采取舉措,如用取樣工具進(jìn)行取樣圖 11-11.此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣.用高壓滅菌器使其滅菌或是連 接后用蒸汽滅菌,滅菌結(jié)束后將樣品從罐中取出送入樣品管中.取完所需的樣品, 卸下之前對(duì)取樣管道再次滅菌.卸下經(jīng)滅菌的連結(jié)器,在平安柜中卸下樣品管.取 樣中使用的排水管管道與廢液滅菌貯罐相連,取樣及滅菌時(shí)產(chǎn)生的排水一并貯存于 罐內(nèi),經(jīng)滅菌后排出.此外還設(shè)計(jì)了各種平安取樣用的器具.例如,通過雙層橡皮 膜,用注射器取樣

30、；把可移動(dòng)的完全密封型的球形箱與取樣管連接,在此箱中取樣但是這些操作都由人工限制,操作中難免出錯(cuò).為了減少操作人員接近工程菌的時(shí)機(jī),盡量不用人工操作而采用自動(dòng)取樣裝置最為平安.圖 11-12為自動(dòng)取樣裝 置的流程圖.取樣方法與人工取樣程序大致相同.同時(shí),取樣過程因采用程序系統(tǒng) 限制而易于變動(dòng).取出的樣品保存于冷庫(kù)內(nèi),冷庫(kù)內(nèi)的空氣經(jīng)濾器過濾,內(nèi)部也可 進(jìn)行滅菌.4,培養(yǎng)后的滅菌培養(yǎng)后對(duì)培養(yǎng)液和管道等進(jìn)行滅菌時(shí),一開始流出的末滅菌排水有可能存在活 的重組菌.取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水,因此,一定要另行安裝排水管并 與廢液滅菌貯槽等相連接,以便徘放污水.5,接種向罐內(nèi)直接接種的方法是不平安的.簡(jiǎn)單的平安接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以 管相連接后,用無菌空氣加壓壓入的方法.另一種方法是先把種子液在平安柜內(nèi)移 至供接種用的小罐內(nèi),再將其與培養(yǎng)罐連接,用蒸汽對(duì)連接局部滅菌后,把種子罐 中的種子液接入培養(yǎng)罐內(nèi).lA圖11-12自動(dòng)取律裝立1 .婚舞博,21 3 ,無陵水貯箱1 4 ,雷水歸箱.5 ,移岸6,排液培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序,