分光光度計和流式細胞儀介紹

1、吸光分光光度計吸光分光光度計 在光譜分析中，依據(jù)物質對光的選擇性吸收而建立起來在光譜分析中，依據(jù)物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法的分析方法稱為吸光光度法, ,主要有主要有: : 紅外吸收光譜：紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍分子振動光譜，吸收光波長范圍2.5 1000 m ,主要用于有機化合物結構鑒定。主要用于有機化合物結構鑒定。 紫外吸收光譜：紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200 400 nm（近紫外區(qū)）（近紫外區(qū)） ，可用于結構鑒定和定量分析。，可用于結構鑒定和定量分析。 可見吸收光譜：可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收

2、光波長范圍電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400 750 nm ，主要用于有色物質的定量分析。，主要用于有色物質的定量分析。 紫外可見吸收光譜紫外可見吸收光譜 1 1光的基本性質光的基本性質 光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長波長 、頻率、頻率 、光速、光速c、波數(shù)（、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述：）等參數(shù)來描述： = c ； 波數(shù)波數(shù) = 1/ = /c 光是由光子流組成，光子的能量：光是由光子流組成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常數(shù)常數(shù)：h=6.626 10 -34 J S ) 光的波長越短（頻率越高），

3、其能量越大。光的波長越短（頻率越高），其能量越大。 白光白光(太陽光太陽光)：由各種單色光組成的復合光：由各種單色光組成的復合光 單色光單色光：單波長的光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成由具有相同能量的光子組成) 可見光區(qū)可見光區(qū)：400-750 nm 紫外光區(qū)紫外光區(qū)：近紫外區(qū)：近紫外區(qū)200 - 400 nm 遠紫外區(qū)遠紫外區(qū)10 - 200 nm （真空紫外區(qū)）（真空紫外區(qū)） 2. 2. 物質對光的選擇性吸收及吸收曲線物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M + 熱M + 熒光或磷光 E = E2 - E1 = h 量子化量子化 ；選擇性吸收；選擇性吸收; 分子結構的復雜性使其對分子結構的

4、復雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；不同波長光的吸收程度不同； M + h M *基態(tài)基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)E1 （E） E2吸收曲線的討論：吸收曲線的討論：（1）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似狀相似max不變。而對于不同物質，它們的吸不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和收曲線形狀和max則不同。則不同。 （2）吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據(jù)）吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據(jù)之一。之一。 （3）不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度 A 有差異，在有

5、差異，在max處吸光度處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據(jù)。的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據(jù)。光的吸收定律光的吸收定律朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格(Bouguer)(Bouguer)和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。濃度之間也具有類似的關系。A A c c 二者的結合稱為

6、朗伯二者的結合稱為朗伯比耳定律比耳定律朗伯朗伯比耳定律數(shù)學表達式比耳定律數(shù)學表達式 Alg（I0/It)= b c 式中式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；：吸光度；描述溶液對光的吸收程度； b：液層厚度：液層厚度(光程長度光程長度)，通常以，通常以cm為單位；為單位； c：溶液的摩爾濃度，單位：溶液的摩爾濃度，單位molL； ：摩爾吸光系數(shù)，單位：摩爾吸光系數(shù)，單位Lmolcm； 或或: Alg（I0/It)= a b c c：溶液的濃度，單位：溶液的濃度，單位gL a：吸光系數(shù)，單位：吸光系數(shù)，單位Lgcm a與與的關系為：的關系為： a =/M （M為摩爾質量）為摩爾質量） 透光度透

7、光度( (透光率透光率) )T T透過度透過度T : 描述入射光透過溶液的程度描述入射光透過溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A與透光度與透光度T的關系的關系: A lg T 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的依據(jù)。應用于各種光度法的吸收測量；依據(jù)。應用于各種光度法的吸收測量；流式細胞術的基本概念流式細胞術的基本概念 流式細胞術（流式細胞術（Flow Cytometry, Flow Cytometry, 簡稱簡稱FCMFCM）是一種）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測

8、快速直線流動狀態(tài)中的單個細胞的多項物理及生物學特性，線流動狀態(tài)中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術，加以分析定量的技術，同時可以對特定群體加以分同時可以對特定群體加以分選選。散射光信號散射光信號 當細胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束當細胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束 方向同軸的稱前向角散射光信號（方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為）。與激光束垂直的稱為 側向角散射光信號（側向角散射光信號（SSC）。）。散射光信號散射光信號Right Angle Light Right Angle Light Detecto

9、r Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Forward Light Detector Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSC FSCIncident Incident Light Light SourceSource外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）（紅細胞溶解后） 顆粒雜質、氣泡顆粒雜質、氣泡對檢測的影響對檢測的影響熒光信號熒光信號 使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析 熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光樣本制備熒光樣本制備雙色直接染色雙色直接染色數(shù)據(jù)存儲數(shù)據(jù)存儲 FCS 2.0格式格式 常以列表