蛋白純化protocol

1、常見的實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)l 貴重的親和層析樹脂經(jīng)常發(fā)生結(jié)塊該怎么辦？ 可用 0.1 N NaOH / 0.1% SDS 洗 結(jié)塊l Ni-chelating錯(cuò)用DTT后發(fā)生黑色沉淀該怎么辦？ 盡快用0.1 N HCl沖洗l Nandrop: 帳號(hào) 李大偉老師(li d w) 密碼： 62732710l 自己的超聲波： 用大10頭, 功率 600W；用小3頭, 功率不大于 200Wl 如果pcr不成功,可能是pfu出了問題，也許是pfu沒有活力（太多，太少或者buffer不對(duì)）l 做酶切回收的質(zhì)粒一定要用kit提l 質(zhì)粒連不上可能是膠回收問題，最好加異丙醇，終濃度可達(dá)50l 做SDS-PAGE的30丙

2、烯酰胺一定要過濾l 蛋白質(zhì)離心濃縮一定要用水平轉(zhuǎn)子l 蛋白質(zhì)純化一定用milli Q的水，最好每步都加1mM DTTl 所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存l mono Q 結(jié)合蛋白質(zhì)洗脫不下來, 可能都被mono Q吸附上雜質(zhì)或長(zhǎng)菌,可能是柱子上濾膜出了問題Mono Q洗柱子的方法: (實(shí)在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 飽和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 vol 每周都要洗一次Superpose 6洗柱子的方法:

3、(實(shí)在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 飽和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 volpH 8 調(diào)到 用1M溶液調(diào)pH值 pH6.0 1:4, 一般是1:10pet 15b 加上Met MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM 共21個(gè)氨基酸pet 32b 除去 trx MHHHHHHSSGLGGENLYFQGS 共21個(gè)氨基酸300ml 10N NaOH 非精制胰蛋白胨/L370ml 10N NaOH 精制胰蛋白胨Trx: 14.

4、6kDa pI 5.9Tev ： pI 8.5u可溶于堿的污染物 0.1 mol/L NaOH洗滌 Milli-Q純化的蒸餾水洗滌 結(jié)合緩沖液洗滌 可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。u對(duì)于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌可以除去脂類和其他的疏水性物質(zhì)。u金屬污染物 EDTA飽和的10 mmol/L HCl（即pH=2）處理柱子u沉淀物雜質(zhì)去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌Centrifuge samples to avoid the risk of non-specific binding of

5、 the target molecule to afilter. Samples such as serum can be filtered through glass wool to remove remaining lipids.Non-specific cause: proteins binding to medium and/or to the plastic tubes or the presenceof protein aggregates that co-precipitate with the immune complexIt is reported that CHAPS st

6、abilizes GR and prevents non-specific adsorption of GR to tubes and mono-beads 6 and 7. T.M. Fletcher, B.S. Warren, C.T. Baumann and G.L. Hager. Methods Mol. Biol. 176 (2001), p. 55. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (1)7.載體： 7.5 ulNEB buffer 2 1ulBSA 0.25ulT4 dna p

7、ol 0.25ul100mm dttp 0.5ul100mm Dtt 0.5 ul反應(yīng)體系于22 30min后，75 20min將酶滅活。（另：一個(gè)文獻(xiàn)上沒有說明的優(yōu)點(diǎn)，NEB T4 DNA POL在普通的限制性內(nèi)切酶Buffer中的活性為100%，也就是說，載體酶切后不用乙醇沉淀，就可以直接用于T4處理，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，節(jié)省時(shí)間 pfu也可以，實(shí)驗(yàn)室協(xié)議 前期工作1 進(jìn) 查是否已經(jīng)有結(jié)構(gòu)發(fā)表，特別注意 unreleased 部分2 進(jìn) 搜索目標(biāo)基因， 輸入基因名， 找出對(duì)應(yīng)的種屬 把之下載，看看這個(gè)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)，如是否有發(fā)表的結(jié)構(gòu)、功

8、能、是否有跨膜區(qū)、所含的domain（可以進(jìn)入InterPro、pfam和 smart看看）、氨基酸序列、mRNA或genomic DNA序列等。3 找出蛋白所對(duì)應(yīng)的mRNA序列如果基因是從別人獲得，直接向別人要mRNA序列或DNA序列如果基因是從庫中PCR獲得，那么從ncbi (/entrez/query.fcgi?db=gene) 中輸入基因名， 找出對(duì)應(yīng)的種屬。點(diǎn)擊進(jìn)入，里面有很多文獻(xiàn)，介紹內(nèi)容比較全面，找出mRNA and Protein(s) 點(diǎn)擊找出 mRNA序列或genomic DNA序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)1

9、中找出 Proteomics and sequence analysis tools 下的 Secondary里面的內(nèi)容很全， 有計(jì)算 Compute pI/Mw 計(jì)算等電點(diǎn)和分子量PeptideCutter 預(yù)測(cè)蛋白酶可能的酶切位置Tertiary structure prediction 在我們關(guān)心的 Secondary structure prediction 下 主要是 PSIpred 最有名，也是最常用的 當(dāng)然還有 PredictProtein 也偶爾用一下2. 另外一個(gè)預(yù)測(cè)的站點(diǎn)： http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/dompred/DomPredform.html

10、這個(gè)站點(diǎn)可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的各個(gè)domain的可能位置，可以大概告訴我們?cè)谀睦锇训鞍浊械舯容^合適，里面的結(jié)果也含有PSIpred的結(jié)果。1.進(jìn) 查是否有發(fā)表的結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有很多沒有unreleased 部分。這是否代表結(jié)構(gòu)已經(jīng)解出，我要放棄這個(gè)蛋白 ？   差不多可以這么說。 不過還要看情況， 如果別人解出的蛋白質(zhì)僅是部分序列，那如果做別的片段或者全長(zhǎng)就可以做。 還是就是如果做復(fù)合物也還是可以做。          2.很多蛋白查出是做了某個(gè)d

11、omain和DNA或肽段的復(fù)合物或者整個(gè)蛋白和別的蛋白某個(gè)domain的復(fù)合物，這種情況下還可以做這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)嗎？ 如果做得和別人的不一樣，也是可以做的。 如果很類似的話， 發(fā)文章就很難發(fā)好雜志。             3.有些蛋白在搜索結(jié)果是No exact matches found, so fuzzy search used，這是否代表沒有做出結(jié)構(gòu)？  差不多可以這么說。3. 尋找同源的結(jié)構(gòu):http:/www.ebi.ac.uk/blast2/index

12、.html在 Uniprot Knowledgebase 中選擇 Protein structure sequence. 再輸入序列即可運(yùn)行.一般認(rèn)為 最小的E()大于0.01(或同源性低于30以上；有時(shí) e-20,有時(shí)也可以 0.01), 就認(rèn)為沒有同源的結(jié)構(gòu)被解出.E()越小, 差異越小.        設(shè)計(jì)引物我最常用的軟件的 generunner, 下面是我按generunner的內(nèi)容來介紹如何設(shè)計(jì)引物1 實(shí)驗(yàn)室常用的載體：gstmt（載體模板是pgex-4T-2, TEV，通過LIC方法連接, GST t

13、ag,氨芐抗性）32bmt（載體模板是pet32b, TEV，通過LIC方法連接, His tag和Trx tag,氨芐抗性）32bsumomt（載體模板是pet32b, TEV，通過LIC方法連接, sumo tag和兩個(gè)His tag,氨芐抗性）2 實(shí)驗(yàn)室常用的菌種： 克隆菌種： DH5 表達(dá)菌種： BL21(DE3), Rosetta 2 (DE3), Rosetta gami B plys (DE3) 更多的見另外一個(gè)表3 設(shè)計(jì) primer 一般是在上述的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，有點(diǎn)常見的要求：a: 一般匹配的堿基18個(gè)左右， 我主要是根據(jù)匹配堿基的溫度大于等于54度。 溫度A或

14、T含量×2 G或C含量×4b: 把酶切位點(diǎn)加在匹配的堿基的5端，注意不要錯(cuò)位防止產(chǎn)生亂碼。c: 如果不想通過T載體連接，一般要求在酶切位點(diǎn)外加34個(gè)保護(hù)堿基。d: 要仔細(xì)查所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，防止所表達(dá)的蛋白堿基也有設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)e: 最好在設(shè)計(jì)之后再仔細(xì)檢查所有的引物一遍。 The protocol of express geneLIC Protocol1. 載體(一定要用kit提質(zhì)粒, 必須是從無甲基化菌種提的質(zhì)粒, 無dcm，dam甲基化)用STU I單酶切(buffer M, takara), PCR產(chǎn)物(PCR盡量少用Taq)分別用凝膠回收 (一定要回收)后，載體（

15、可以不用凝膠回收，直接乙醇沉淀即可）重溶20-40ul, PCR重溶30-50ul.2. pfu末端處理Fragment(PCR) 7ul Pfu(一定是原液 2.6mg/ml) 0.25 dATP(10mM) takara 0.5 pfu Buffer(×10 無Mgcl2) 1 25mM Mgcl2 0.25H2O 1 Total 10ul72度反應(yīng)30minFragment(Vector) 7ulPfu（一定是原液 2.6mg/ml） 0.25uldTTP(10mM) 0.5ulpfu Buffer(×10 無Mgcl2) 1 25mM Mgcl2 0.25H2O 1

16、 Total 10ul72度反應(yīng)30min72度反應(yīng)30min 3. 連接Fragment（PCR） 10ulFragment（Vector） 5ulT4 ligase 0.5ulT4 ligase Buffer 2ulH2O 2.5ul不用調(diào)pH直接連接有點(diǎn)， 不加連接酶不行16度放置2-20小時(shí), 加入 感受態(tài)細(xì)胞DH5alpha 或top10，置于冰上30min, 42度熱激90s, 冰上放置5min, 將菌液涂于相應(yīng)抗性的Amp平板上。4. 把平板放置在37度培養(yǎng)箱中,一般培養(yǎng)12-20小時(shí).挑選克隆小搖并進(jìn)行驗(yàn)證.5. Transformed the right plasmid to

17、 expression cell (BL21(DE3), Rossetta(DE3), ER2566) and express the target.6. The express cell was added to LB buffer contain the right resistance, and shake at 37 degree. When the OD600 reach at 0.6-0.8, add IPTG to the LB buffer make the final concentration of IPTG is 0.1-1mM, and shake 3-5h at 37

18、 degree or 25 degree overnight.7. Centrifuged the cell at 4000rpm 15 min, collect the precipitation. GST蛋白的純化方法所有的水必須是Mill Q的水! 蛋白純化過程盡量減少泡沫11/20-1/50體積的緩沖液(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl, 0.1-1mg/ml lysozyme，1mM DTT后加， 0.1%-1% triton X-100（一般在最后用于長(zhǎng)晶體的蛋白時(shí)不要）)攪起細(xì)胞, 經(jīng)常要用研磨器把大跎的菌體分散，一般加入1mM PMSF, 4度放置

19、30分鐘，再4度冰上超聲破碎細(xì)胞（6min, 2 sec on, 4 sec off, 30%功率）。2. 4度12000rpm離心1 小時(shí). 如果蛋白是可溶的，收集上清。如果不可溶，則收集沉淀，另外用別的方法處理包涵體，有時(shí)要留樣跑膠。3.對(duì)上清合并，把溶液調(diào)為Tris pH 7.3，可以上GST beads(見后面如何平衡的柱子)4. 用恒流泵循環(huán)過GST beads 3次，每次流速約2ml/min.5.用buffer(20mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl，1mM DTT)洗柱子10個(gè)柱體積，把液體流盡。下面的方法選一個(gè)6a. 可用1-2柱體積的buffer(20

20、mM Tris pH 7.3 and 150mM NaCl，這時(shí)pH值或鹽濃度可以改變，1mM DTT)，再加1/100體積的TEV蛋白酶4度過夜切。第二天收集液體。柱子可以用(0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5)的溶液洗，或下面的溶液洗。如果是第一次做，最好先保存，等SDS-PAGE結(jié)果出來后再說。6b. 用含10mM GSH(還原型的谷胱甘肽) 的buffer(20mM Tris，150mM NaCl，1mM DTT，這時(shí)一定要調(diào)pH值，保證pH值要對(duì)，因?yàn)楣入赘孰暮芩?。如果保存的話,要加甘油至最終10-15%的甘油并保存在-86度。最后G

21、ST beads保存20乙醇中，在4度的冰箱中保存。GST beads的再生方法：washing the gel with 2-3 bed volumes of alternating high pH (0.1 M Tris-HCl + 0.5 M NaCl, pH 8.5) and low pH (0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5) buffers. This cycle should be repeated 3 times GST beads的平衡方法： equilibration with 3-5 bed volumes of緩沖液(20

22、mM Tris pH 7.3 and 500mM NaCl,1mM DTT)His蛋白的純化方法所有的水必須是Mill Q的水! 蛋白純化過程盡量減少泡沫11/20-1/50體積的緩沖液(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl, 0.1-1mg/ml lysozyme，5-20mM 咪唑，0.1%-1% triton X-100（一般在最后用于長(zhǎng)晶體的蛋白時(shí)不要）)攪起細(xì)胞, 經(jīng)常要用研磨器把大跎的菌體分散，一般加入1mM PMSF, 4度放置30分鐘，再4度冰上超聲破碎細(xì)胞（6min, 2 sec on, 4 sec off, 30%功率）。2. 4度12000rpm

23、離心1 小時(shí). 如果蛋白是可溶的，收集上清。如果不可溶，則收集沉淀，另外用別的方法處理包涵體。3.對(duì)上清合并，一般情況下不用調(diào)溶液的pH值，可以上已經(jīng)平衡好的His beads(見后面的平衡方法)4. 用恒流泵循環(huán)過His beads 3次，流速約2 ml/min.5.用buffer(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl，20mM 咪唑)洗柱子10個(gè)柱體積，把液體流盡。這一步驟從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看還是要的.6.用buffer(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl，60mM 咪唑這個(gè)濃度可以改)洗柱子10個(gè)柱體積，把液體流盡。有時(shí)這個(gè)步驟會(huì)洗下目標(biāo)

24、蛋白。7.用buffer(20mM Tris pH 8.0,(這時(shí)pH可以根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)改變), 150mM NaCl，250mM500mM 咪唑)或者用不含咪唑的、低pH如4的溶液或者EGTA或 EDTA洗脫 洗脫柱子12個(gè)柱體積，收集保存。8. 最好通過濃縮的辦法把上述收集液體中的咪唑去掉.如果保存的話,要加甘油至最終10-15%的甘油并保存在-86度.最后His beads保存20乙醇中，在4度的冰箱中保存。His beads的再生方法：washing the gel with 2-3 bed volumes of 50mM EDTA溶液至beads完全變?yōu)榘咨? 接著用2-3 be

25、d volumes of水洗，再加2-3 bed volumes of 50mM NiCl2溶液beads完全變?yōu)樘m色.His beads的平衡方法： equilibration with 3-5 bed volumes of緩沖液(20mM Tris pH 8.0 and 500mM NaCl,1mM DTT)破細(xì)胞溶液: 20mM Tris pH 8, 0.5% triton, 10mM 咪唑 500mM NaCl, 沒有加 pmsf. 用60mm咪唑, 20mM Tris pH 8, 500mM NaCl 漂洗, 最后用 20mM Tris pH 8, 250mM 咪唑,300mM Na

26、Cl洗脫; 濃縮時(shí)一定加鹽所有的水必須是Mill Q的水!如果是TA克隆轉(zhuǎn)的T載體，平板不長(zhǎng)菌，一般有幾種原因：1、感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率；2、操作的原因3、SOC培養(yǎng)基4、抗性是否正確你可以參考以上幾點(diǎn)找找原因。片段加A后需要進(jìn)行純化，純化在與載體連接。4、 取10ul 連接產(chǎn)物（如果做電轉(zhuǎn)化，連接產(chǎn)物需要純化）加入至100ul 化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（DH5或JM109 等感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率在5×106 cfu/ug pUC19 DNA 以上）中冰浴15 分鐘。5、 42 度熱擊70-90 秒（根據(jù)離心管厚薄調(diào)整時(shí)間）后，再在冰浴15 分鐘。6、 加入890 ul SOC 培養(yǎng)基，37振

27、蕩 ( 150rpm/min ) 培養(yǎng)1 小時(shí)2、 為什么PCR 產(chǎn)物難以插入載體？A、 確認(rèn)PCR 反應(yīng)使用的Taq 酶在PCR 產(chǎn)物的3端是否附加了“A”。高保真Taq 酶擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物是平端，不能直接用于TA 克?。籔CR 產(chǎn)物保存時(shí)間不要過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間保存的PCR 產(chǎn)物會(huì)脫去末端的“A”堿基。B、 膠回收時(shí)PCR 產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時(shí)間太長(zhǎng)。C、 確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞1ng pUC18 質(zhì)粒至少應(yīng)得到1000 個(gè)以上的轉(zhuǎn)化子，如有問題，重新制備感受態(tài)細(xì)胞。D、 確認(rèn)抗生素使用是否正確，pBM-T 載體為Amp 抗性，工作濃度100ug/ml。E、 最好使用新

28、配制的平板培養(yǎng)基。F、連接中使用了不恰當(dāng)?shù)妮d體：插入片段比例，對(duì)于極小的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆，很可能因?yàn)镻CR 產(chǎn)物嚴(yán)重過量，導(dǎo)致無菌落或菌落極少存放：超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞必須從干冰運(yùn)送包裝箱取出直接放入80°C冰箱的底部。一定不要用液氮來存感受態(tài)細(xì)胞。存放條件：超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)微小的溫度改變也極度敏感，因此必須存放在80°C冰箱的底部。即使是將細(xì)胞從一個(gè)冰箱轉(zhuǎn)移到另一個(gè)冰箱也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的損失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圓底試管：在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用圓底14-ml BD Falcon聚丙烯試管（貨號(hào) #352059）也是關(guān)鍵之一。一般的試管容易被b-巰基乙醇降解。而

29、極為重要的熱激步驟的操作也是根據(jù)這種型號(hào)的試管優(yōu)化的。分裝細(xì)胞：分裝細(xì)胞時(shí)務(wù)必保持置于冰上。將聚丙烯管放置在冰上等待細(xì)胞融化，分裝的細(xì)胞裝入預(yù)冷的試管中。而且，每次轉(zhuǎn)化都用100 ml細(xì)胞也很重要，減少細(xì)胞體積必定減少轉(zhuǎn)化效率。使用b-巰基乙醇(b-ME): 已經(jīng)證明b-ME可以幫助提高轉(zhuǎn)化效率。Stratagene提供的b-ME已經(jīng)過稀釋，可以直接使用。其它來源的b-ME使用時(shí)請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。使用NZY+ 肉湯：Stratagene的超級(jí)、高級(jí)感受態(tài)細(xì)胞在熱激處理后用NZY+ 培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)最好。用其它培養(yǎng)基替代往往會(huì)造成效率降低。I can't give a mechanism,

30、but I can tell you that one major method of makinghigh-efficiency competent cells-and one of which there many variants-usesDMSO and DTT to achieve maxiumum efficiency. A possible mechanism would be that_if_ there were any periplasmic DNases, which are likely to possess disulfidebonds, the DTT (or BM

31、E) will inactivate them. DTT facilitates the inactivationof extracellular RNases for this reason.Add 7 ul DTT solution/200 ul culture, swirl and leave on ice for 5 mins.1.42 M -mercaptoethanolAdd 1.7 l of -mercaptoethanol provided with this kit or a fresh1:10 dilution (of a 14.2 M stock) of -mercapt

32、oethanol diluted indistilled water (dH2O) to the 100 l of competent cells, giving a finalconcentration of 25 mM.1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制