BP1基因在急性白血病患者中的表達(dá)及相關(guān)研究

1、BP1基因在急性白血病患者中的表達(dá)及相關(guān)研究 作者：徐桂峰，徐開林，潘秀英【摘要】 目的 探討B(tài)P1基因在急性白血病患者中的表達(dá)及其臨床意義。方法 運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測HEL白血病細(xì)胞系(BP1陽性細(xì)胞株)、92例急性白血病(AL)患者及10名正常對(duì)照者BP1基因的表達(dá)水平;分析其在急性白血病中的表達(dá)規(guī)律及與臨床預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 10名正常人和急性淋巴細(xì)胞白血病患者的骨髓細(xì)胞中無BP1基因表達(dá)(陰性);HEL細(xì)胞系BP1陽性;急性髓系白血病(AML)患者BP1基因總陽性率42.59%，在各亞型AML中均表達(dá)，AML各亞型間的陽性率無差異(P>0.05

2、)。AML初治、復(fù)發(fā)、完全緩解的BP1基因陽性率分別為50.00%、46.15%、11.11%，各組間無明顯差異(P>0.05)。AML初治患者中BP1陽性表達(dá)者首次完全緩解(CR1)后緩解持續(xù)時(shí)間短于BP1陰性表達(dá)者(P<0.01)，早期病死率(確診后3個(gè)月內(nèi)死亡)明顯升高(P<0.01)。結(jié)論 BP1基因在AML中有異常高表達(dá)，具有髓系特異性，可作為區(qū)別淋系和髓系的標(biāo)志性基因。BP1基因在AML的發(fā)病中可能起一定作用，可作為判斷AML預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】 急性白血病;BP1基因;基因表達(dá)Abstract: Objective To inve

3、stigate the expression of BP1 gene in patients with acute leukemia and its significance. Methods BP1 level was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in HEL leukemia cell line in 92 patients with acute leukemia and 10 healthy volunteers. The regularity of the expressi

4、on of BP1 gene in acute leukemia and the relationship between BP1 level and prognosis of leukemia was explored. Results BP1 mRNA was not expressed in 10 healthy volunteers and patients with acute lymphoid leukemia, while it was positive in HEL cell line. The total positive rate of BP1 gene expressio

5、n in AML was 42.59%. BP1 gene was expressed in all subtypes of acute myelogenous leukemia, with no marked difference (P>0.05). The positive rate was 50.00% for the newly diagnosed, 46.15 % for those with relapse and 11.11% for those with complete remission. There were no significant differenc

6、es in positivity among groups (P>0.05). The remission phase after CR1 was shorter in BP1 (+) patients than in the (-) ones, and the early mortality rate was higher in the former than in the latter (P<0.01). Conclusion BP1 was abnormally overexpressed in acute myelogenous leukemia, whic

7、h suggests that it is myelogenous specific and could serve as a marker gene to distinguish myelogenous and lymphoid genes. BP1 gene may play an important role in the pathogenesis of some myeloid malignancies and serve as an index to AML prognosis.Key words: acute leukemia; BP1 gene; gene expression同

8、源盒基因是一組轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，以種系特異性和階段特異性的方式在造血增殖分化和胚胎發(fā)育中起調(diào)控作用1。BP1基因定位于17號(hào)染色體q21-22，近鄰HOXB族，且位于3端2，為一原癌基因，理論上參與較早期的造血干祖細(xì)胞的分化。國內(nèi)外資料表明，BP1基因與髓系惡性血液病的發(fā)生相關(guān)，但尚缺乏深入研究。本實(shí)驗(yàn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測BP1在不同類型急性白血病患者中的表達(dá)，探討其在急性白血病發(fā)病及預(yù)后等方面的意義。1 資料和方法1.1 研究對(duì)象1.1.1臨床病例 收集2005年6月2007年2月間徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科住院的急性白血病(AL)患者92例，男性58例，女性34例，男女

9、=1.71。年齡10歲72歲，平均(38.58±8.24)歲。全部標(biāo)本經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)、組化及免疫表型檢測，符合FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)。92例AL中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)38例，急性髓系白血病(AML)54例(M1 8例 ，M2 17例，M3 8例，M4 5例，M5 13例，M6 2例,M7 1例)。初治58例，復(fù)治20例，緩解后14例。所有被觀察的AML初治患者均接受標(biāo)準(zhǔn)的柔紅霉素+阿糖胞苷(DA)、高三尖杉酯堿+阿糖胞苷(HA)、米托蒽酯+阿糖胞苷(MA)等方案誘導(dǎo)緩解治療。M3患者主要應(yīng)用維甲酸及(或)亞砷酸治療。ALL采用長春新堿+柔紅霉素(環(huán)磷酰胺)+左旋門冬酰胺酶+潑尼松或長

10、春新堿+米托蒽醌(環(huán)磷酰胺)+左旋門冬酰胺酶+潑尼松方案。1.1.2 對(duì)照組 正常對(duì)照組10例，男性6例，女性4例，平均年齡(30.62±6.80)歲。均為正常獻(xiàn)血員。1.1.3 BP1基因陽性細(xì)胞株 HEL細(xì)胞系均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所。1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑、Tag酶、6-merprimers、dNTPs(SANGO公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)，DEPC(AMRESCO公司)，DNA Ladder(MBI公司)，9600 PCR基因擴(kuò)增儀(PE公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，PCR引物由GIBCO公司及上海生工合成。BP1引物序

11、列(擴(kuò)增產(chǎn)物581 bp):上游： 5-CACCTCCTGTCTTACCCCTACACC-3;下游：5-GCCCTTCCCCAGATACACATCTAG-3;內(nèi)對(duì)照GAPDH引物(擴(kuò)增產(chǎn)物306 bp)：上游：5-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3;下游:5-AGCCTTCTCCATGGTGAAGAC-3。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 BP1基因檢測采用RT-PCR方法。1.3.1 單個(gè)核細(xì)胞(MNC)分離 取外周血5 ml或骨髓液2 ml，肝素抗凝，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液3 ml分離出單個(gè)核細(xì)胞，用1×PBS洗滌23次，-80保存?zhèn)溆没蛑苯犹崛?取5×107個(gè)M

12、NC用于細(xì)胞總RNA提取)。HEL細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，收集HEL細(xì)胞，PBS洗滌2次，取1×107個(gè)細(xì)胞用于提取RNA。1.3.2 總RNA提取 采用Trizol試劑一步法提取總RNA。參照說明書進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞RNA抽提，所抽提總RNA經(jīng)分光光度計(jì)測定光密度，D260/D280值在1.851.98者用于提取RNA。1.3.3 cDNA第1鏈合成 40 l反應(yīng)體系包括：4 l總RNA，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液8 l，2.5 mmol/L dNTP 6 l,20 mol/L 6-merprimers 5 l,300 mol/L MLV。37、60 min;95、5 mi

13、n 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。1.3.4 PCR反應(yīng) 50 l BP1反應(yīng)體系包括：cDNA 8 l，10×PCR緩沖液5 l ，25 mmol/L MgCl 23 l,上、下游引物各5 l ，2.5 mmol/L dNTP 2 l ，Tag酶0.5 U，補(bǔ)雙蒸水至50 l。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性5 min;94變性60 s;60退火1 min, 72延伸2 min;循環(huán)35次后72延伸8 min。1.3.5 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 PCR產(chǎn)物及內(nèi)對(duì)照各4 l加上2 l溴芬蘭上樣緩沖液混勻，加樣于2%瓊脂糖凝膠上，以100 bp Ladder DNA marker同時(shí)加樣作為標(biāo)志。80 V恒壓，電泳6

14、0 min，EB染色，在UVP凝膠成像系統(tǒng)下攝片。1.4 病例隨訪 在采集標(biāo)本的同時(shí)詳細(xì)收集患者的臨床資料及隨訪聯(lián)系方法，通過門診、電話、信訪等多種途徑進(jìn)行隨訪。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 t檢驗(yàn)、2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：=0.05。2 結(jié) 果2.1 對(duì)照組BP1基因的表達(dá) 10例正常人及38例ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中無BP1基因的表達(dá)(陰性)，HEL細(xì)胞系BP1基因表達(dá)陽性。電泳結(jié)果見圖1。圖1 正常人骨髓、外周血、完全緩解患者、ALL患者骨髓BP1基因的表達(dá)1：正常人骨髓;2：正常人外周血;3、4：完全緩解患者;5：ALL患者骨髓;M：100 bp

15、DNA marker2.2 AML不同F(xiàn)AB分型中BP1基因的表達(dá) GAPDH 特異擴(kuò)增條帶306 bp，BP1引物由于跨越了一個(gè)可變性剪接位點(diǎn)而產(chǎn)生了2個(gè)PCR產(chǎn)物(201 bp和380 bp)，見圖2。由表1可見，AML各亞型間BP1基因表達(dá)的陽性率無顯著差別(P>0.05)。表1 BP1基因在AML各個(gè)亞型中的表達(dá)AML各亞型間BP1基因表達(dá)的陽性率無顯著差別，P>0.052.3 BP1基因表達(dá)與AML臨床特征的關(guān)系 由表2可見， AML中BP1基因陽性表達(dá)與性別、年齡、白細(xì)胞數(shù)、完全緩解有關(guān):男性患者BP1基因的陽性表達(dá)高于女性，兩者有顯著性差異(P&

16、;lt;0.05);年齡>45歲表達(dá)高(P<0.05);白細(xì)胞>100×109/L時(shí)BP1基因表達(dá)高(P<0.05);BP1陽性表達(dá)組比陰性組完全緩解率(CR)低(P<0.05)。與骨髓原始、幼稚細(xì)胞數(shù)及CD34是否陽性無關(guān)(P>0.05)。2.4 AML初步隨訪結(jié)果 32例初治患者中BP1基因表達(dá)陽性16例(50.00%);13例復(fù)發(fā)患者中有6例(46.15%)BP1基因陽性;9例完全緩解患者1例(11.11%)BP1基因陽性。復(fù)發(fā)患者BP1基因表達(dá)(46.15%)與初治患者表達(dá)(50.00%)無顯

17、著的差異(P>0.05)。部分初治、復(fù)發(fā)病例的電泳結(jié)果見圖3。表2 AML患者BP1基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系PR：部分緩解;CR：完全緩解;NR：未緩解。WBC為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，加用秩和檢驗(yàn)Z值為-4.049，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*：自完全緩解后開始計(jì)算，隨訪截至2007年2月28日。#:初診后開始計(jì)算，生存期3個(gè)月由表2可見：23例BP1陽性的AML患者經(jīng)DA、MA或HA標(biāo)準(zhǔn)化療12個(gè)療程，M3患者經(jīng)亞砷酸或維甲酸誘導(dǎo)治療12個(gè)月，9例達(dá)完全緩解，完全緩解率9/23(39.13%)與BP1陰性者23/31(74.19%)相比有顯著的差異性。BP1陽性患者生存

18、期較BP1陰性患者生存期短，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)。初治組BP1陽性的AML患者與BP1陰性者相比，CR后持續(xù)緩解時(shí)間短(P<0.01)，自緩解后3個(gè)月內(nèi)早期病死率明顯升高(P<0.01)。3 討 論同源盒基因家族是一類在進(jìn)化過程中高度保守的基因，均含有一個(gè)183個(gè)核苷酸序列編碼的同源蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子起調(diào)節(jié)作用，是胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄過程中的主控基因。同源盒基因首先發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，具有高度保守性，在人類稱HOX基因。研究表明HOX基因與造血調(diào)控密切相關(guān)。例如，HOXB2、B4、HOXC6、C8與紅系調(diào)節(jié)有關(guān)，HOXA9、A10則于粒單

19、系發(fā)育有關(guān)3。本實(shí)驗(yàn)采用敏感度高的RT-PCR方法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常骨髓及成熟的外周血細(xì)胞中無BP1基因表達(dá)。提示：BP1基因在較晚期的造血細(xì)胞及成熟血細(xì)胞中沒有表達(dá)。故推測BP1表達(dá)發(fā)生在早期干細(xì)胞階段，隨細(xì)胞成熟分化表達(dá)量漸下降。Chase等4觀察到：在MB-02細(xì)胞系經(jīng)促紅細(xì)胞生成素(EPO)刺激后開始分化，開始分化時(shí)BP1表達(dá)量開始下降，第4天已不能檢測出，也證實(shí)了這一點(diǎn)。表明BP1的表達(dá)在AML形成中起了重要作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了BP1的表達(dá)與AML預(yù)后間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BP1表達(dá)是否陽性雖與臨床緩解率無關(guān)，但BP1陽性的患者與BP1陰性的患者相比，CR后持續(xù)緩解時(shí)間短，早期死亡率高。提示BP

20、1陽性的患者復(fù)發(fā)率高，近期療效差，生存期短。BP1的高表達(dá)可能是AML患者預(yù)后不良的一個(gè)因素。雖然BP1基因表達(dá)不能作為影響AML預(yù)后的惟一因素，但本研究結(jié)果提示：在同樣使用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案(如DA、HA、MA)時(shí)，BP1基因表達(dá)陽性組患者的緩解率明顯低于基因表達(dá)陰性組患者。同時(shí)，我們調(diào)查了BP1基因表達(dá)與生存期的關(guān)系，雖然BP1基因表達(dá)陽性組患者生存期短，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與影響AML預(yù)后因素多、樣本量小以及隨訪時(shí)間短有關(guān)。同源盒基因還與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，研究表明：在轉(zhuǎn)錄過程中，同源盒基因的激活或阻遏可導(dǎo)致白血病的發(fā)生。HOX基因在早期造血組織中常有表達(dá)。HOX基因的異常表達(dá)或因融合基因

21、的持續(xù)激活的同源結(jié)構(gòu)域?qū)е孪掠伟谢虻某掷m(xù)激活。這些永久性信號(hào)可阻止細(xì)胞的分化或?qū)е略煅绑w細(xì)胞的大量增殖。其中HOXA5表達(dá)的喪失已被證實(shí)是乳腺癌發(fā)生的一個(gè)重要步驟5。BP1作為HOX基因的一種，同樣可能參與腫瘤的形成：將DLX基因?qū)隟562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其在軟瓊脂上的克隆形成能力顯著增加(達(dá)45倍)，而克隆形成能力則是致瘤潛能的標(biāo)志。為此，我們研究了BP1基因與急性白血病的關(guān)系，結(jié)果表明BP1基因在AML各型中均有表達(dá)，而在ALL中均無表達(dá)，此結(jié)果與Shimamoto等6研究結(jié)果有異。Shimamoto等的研究認(rèn)為BP1 在T-ALL中陽性率為32%，在B-ALL中不表達(dá)，有待進(jìn)一步深入分析

22、?？梢酝茢啵築P1可能是一種原癌基因，正常情況下在特定階段出現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化，當(dāng)由于某種原因使得BP1過度表達(dá)時(shí)，則可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因而提示：BP1具有髓系特異性，可作為區(qū)別淋系和髓系的標(biāo)志性基因。綜上所述，BP1基因是一種原癌基因，在AML中有異常高表達(dá)，具有髓系特異性，可作為區(qū)別淋系和髓系的標(biāo)志性基因;在AML的發(fā)病中可能起一定作用，可作為判斷AML預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。【參考文獻(xiàn)】 1 Sauvageau G, Lansdorp PM, Eaves CJ, et al. Differential expression of homeobox genes in functionally distinct CD34+ subpopulations of human bone marrow cells J. Proc Natl Acad Sci USA,1994，91(25):12223-12227.2 Fu S, Stevenson H, Strovel JW, et al. Distinct functions of two isoforms of a