CACNA1F基因在3T3L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)變化的研究

1、CACNA1F基因在3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)變化的研究 作者：劉勇 郭錫熔 潘曉勤 倪毓輝 陳榮華【摘要】 目的 觀察3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中L-型電壓依賴鈣離子通道1F亞基(CACNA1F)基因表達(dá)水平的變化，探討CACNA1F基因與肥胖發(fā)生的關(guān)系。方法 體外培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞，在誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化成熟的不同時段，采用RT-PCR技術(shù)檢測脂肪細(xì)胞中CACNA1F基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 CACNA1F基因在脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)水平較低，隨著脂肪細(xì)胞的分化成熟該基因表達(dá)水平逐漸升高，至分化第810天達(dá)到高峰。進(jìn)一步的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CACNA1F

2、基因的表達(dá)水平在細(xì)胞分化第03天、56天、810天3個時間段內(nèi)無明顯變化外(P0.05)，其余各時間段之間的表達(dá)水平差異均有顯著性(P0.05)。結(jié)論 CACNA1F基因參與了脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控，與肥胖發(fā)生相關(guān)，其在3T3-L1細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化可能有利于脂肪細(xì)胞的分化成熟和脂質(zhì)積聚。 【關(guān)鍵詞】 CACNA1F基因 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞 細(xì)胞分化. 【Abstract】 Objective To investigate the changes of L-type voltage-dependent calcium channel 1F(CACNA1F)gene expression

3、 during 3T3-L1 preadipocyte differentiation.To explore the relationship between CACNA1F gene and the etiology of obesity.Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the matured adipocytes.Total RNA was extracted from adipocytes of various times and the levels of CACNA

4、1F gene mRNA expression were evaluated by RT-PCR.Results In preadipocye，the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained at low.In the presence of inducing reagents，the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in the mature adipocyte.There was a s

5、ignificant difference between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression ，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day，5th to 6th day，8th to 10th day.Conclusion CACNA1F gene is involved in the differentiation of adipoc

6、ytes and related to the etiology of obesity.The changes in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogenesis of adipocytes. 【Key words】 L-type voltage-dependent calcium channel 1F gene 3T3-L1 preadipocyt

7、e cell differentiation 近年來，我國兒童肥胖的發(fā)病率逐漸上升，而且與肥胖相關(guān)的一些疾病，如高血壓、高脂血癥、2型糖尿病等越來越多地出現(xiàn)在兒童群體中，肥胖已成為危害兒童身心健康的嚴(yán)重醫(yī)學(xué)問題；然而肥胖病因復(fù)雜，是機(jī)體在遺傳、環(huán)境、行為、生理、社會、文化等諸多因素相互作用下能量代謝失衡的結(jié)果，因此防治難度極大，一些傳統(tǒng)的肥胖治療方法如控制飲食、減肥藥物等收效甚微，而且由于兒童正處于身心發(fā)育的關(guān)鍵時期，這些方法在兒童中的應(yīng)用受到限制，因此迫切需要尋找安全有效的肥胖控制治療方法。鈣是飲食中一種重要的成分，自從十多年前人們發(fā)現(xiàn)肥胖病人體內(nèi)脂肪細(xì)胞中鈣離子濃度升高以來，鈣與肥胖的關(guān)系

8、逐漸成為一個研究熱點，為尋找控制肥胖及其相關(guān)疾病的治療方法開拓了一片嶄新的視野。研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在與肥胖相關(guān)的能量代謝失衡中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子在調(diào)控脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝和甘油三酯沉積中起著重要作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加導(dǎo)致脂肪合成基因的表達(dá)和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最終增加脂肪積聚而導(dǎo)致肥胖。低鈣飲食可導(dǎo)致1，25-二羥維生素D3的產(chǎn)生增加，刺激鈣離子在細(xì)胞內(nèi)流動從而促進(jìn)肥胖的發(fā)生；而高鈣飲食可以減少脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積聚，增加脂質(zhì)分解，控制體重增加1，2。在這個過程中，鈣離子通道介導(dǎo)的鈣離子細(xì)胞內(nèi)流是一個重要環(huán)節(jié)。因此圍繞著鈣離子通道及其調(diào)控因素開展進(jìn)一步的研究具有重要的意義。

9、由于在先前研究中3，應(yīng)用cDNA array技術(shù)發(fā)現(xiàn)，L型電壓依賴鈣離子通道1F(L-type voltage-dependent calcium channel 1F，CACNA1F)基因差異表達(dá)于肥胖和正常大鼠的脂肪組織中，肥胖狀態(tài)下該基因表達(dá)顯著上調(diào)，提示該基因表達(dá)變化與肥胖發(fā)生密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究該基因與肥胖之間的關(guān)系，本研究在成功誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化成熟的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR技術(shù)觀察CACNA1F基因在前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)水平的變化，以探討該基因與脂肪細(xì)胞分化及肥胖之間的關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 材料 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株由上海中科院

10、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所廖侃教授饋贈，本實驗室傳代留種，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、TRIzol購自美國Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰島素、地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)、DEPC購自美國Sigma公司，油紅O(oil red-O)染料購自上海化學(xué)試劑廠。dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)18、Ex-Taq酶等分子生物學(xué)試劑購自美國Promega公司，PCR Marker購自華美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 3T3-L1前體脂

11、肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 根據(jù)3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化方案4，用完全培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS+100u/ml青、鏈霉素)，在37孵箱(5%二氧化碳，95%空氣)中培養(yǎng)細(xì)胞，每2天換液1次。待細(xì)胞生長至完全融合后2天(第0天)，開始誘導(dǎo)分化，具體步驟為：將培養(yǎng)液換成含0.5mmol/L MIX、1mol/L地塞米松和5mg/L胰島素的完全培養(yǎng)液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液中只含有5mg/L胰島素；2天后換液，撤去胰島素，使用不含有任何誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基；以后每2天換液1次，直至第10天95%以上細(xì)胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞。收集分化不同時間段(010天)的細(xì)胞，置-70凍

12、存?zhèn)溆谩?1.2.2 3T3-L1細(xì)胞鑒定 油紅O染料經(jīng)異丙醇溶解后過濾，置4備用。取分化不同時間段(010天)的細(xì)胞，先用0.01M PBS洗2遍，加入3.7%甲醛固定2min，再用清水洗凈，加入油紅O染液染1h，水洗至背景透明。經(jīng)油紅O染色、蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)中脂滴呈亮紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)色。拍照，記錄細(xì)胞的分化情況。 1.2.3 RT-PCR方法檢測3T3-L1細(xì)胞中CACNA1F基因mRNA的表達(dá)水平 取細(xì)胞200l(約4×105個細(xì)胞)，TRizol法提取3T3-L1細(xì)胞的總RNA，定量后取1g，以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20l。取逆轉(zhuǎn)

13、錄產(chǎn)物1l為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20l。小鼠CACNA1F基因的上游引物序列：5-ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3，下游引物序列：5-CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3，產(chǎn)物長度987bp；內(nèi)參照小鼠GAPDH基因的上游引物序列：5-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3，下游引物序列：5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3，產(chǎn)物長度432bp。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 2min，變性94 30s，退火52 30s(GAPDH基因：52 30s)，延伸72 30s，共30個循環(huán)(GAPDH基

14、因：30個循環(huán))，終末延伸72 5min。所選用PCR反應(yīng)的模板量及循環(huán)數(shù)均使PCR產(chǎn)物量位于反應(yīng)曲線的線性范圍內(nèi)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用UVP凝膠密度掃描儀對CACNA1F基因和CAPDH特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行密度掃描，用Labwork 3.0軟件測定電泳條帶密度值，CACNA1F基因mRNA的表達(dá)水平以該基因條帶密度占GAPDH基因條帶密度的百分比(%)表示。 1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用Excel統(tǒng)計軟件和SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計。多組間均數(shù)比較采用方差分析F檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P0.

15、05示結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 細(xì)胞染色鑒定結(jié)果 誘導(dǎo)分化前，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞呈梭形成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見亮紅色顆粒；細(xì)胞生長至完全融合后2天(第0天)開始誘導(dǎo)分化，第2天到第6天細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，胞體變大變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被油紅O染成亮紅色的脂滴逐漸增多增大；第6天時，約60%的細(xì)胞已分化成熟；第10天時，可見含有亮紅色脂滴的成熟脂肪細(xì)胞在視野中占95%以上，細(xì)胞體積大、形態(tài)圓。 2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中CACNA1F基因表達(dá)水平的變化 見圖1、圖2、表1。由圖表可見，CACNA1F基因在脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)水

16、平較低，隨著脂肪細(xì)胞的分化成熟該基因表達(dá)水平逐漸升高，至分化第810天達(dá)到高峰。進(jìn)一步的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CACNA1F基因的表達(dá)水平在細(xì)胞分化第03天、56天、810天3個時間段內(nèi)無明顯變化外(P0.05)，其余各時間段之間的表達(dá)水平差異均有顯著性(P0.05)。 圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞分化中CACNA1F基因表達(dá)水平的檢測(M：PCR Markers，010：細(xì)胞分化時間) 圖2 3T3-L1脂肪細(xì)胞分化中CACNA1F基因表達(dá)水平的變化 表1 3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中CACNA1F基因的表達(dá)水平 (x±s，%) 注：與第510天各組比較：P均0.01；與第5天比較：P0.

17、05；與第610天各組比較：P均0.01；與第6天比較：P0.05；與第710天各組比較：P0.01；與第7天比較：P0.05；與第810天各組比較：P均0.01；細(xì)胞數(shù)約4×105 3 討論 CACNA1F基因編碼L型電壓依賴型鈣離子通道的一種1亞基1F，既往研究發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞上，介導(dǎo)鈣離子細(xì)胞內(nèi)流，該基因的突變可導(dǎo)致人類遺傳性不完全性聯(lián)夜盲癥(incomplete X-linked congenital stationary night blindness，iCSNB2)5。L型鈣離子通道由1、2、等多條多肽亞基組成，其中1亞基是最重要的功能單位，它形成鈣離子

18、跨膜流通的孔洞通道，既具有離子選擇性，又是電壓感受器，同時也是鈣拮抗劑等大多數(shù)藥物的結(jié)合位點；位于膜內(nèi)的亞基、位于膜外的2亞基及跨膜的亞基共同組成鈣離子通道的附屬部分，起著調(diào)控鈣離子通道的作用68。1有多種類型，由1F亞基組成的鈣離子通道又被命名為CaV1.49。CaV1.4具有以下一些功能特點：它激活快、失活較慢、激活的閾電位較低、對DHP(dihydropyridine，二氫嘧啶，一種鈣離子通道拮抗劑)的中度敏感性以及沒有Ca2+誘導(dǎo)的失活過程10。 本研究通過3T3-L1脂肪前體細(xì)胞體外培養(yǎng)研究首次發(fā)現(xiàn)，CACNA1F基因也表達(dá)于3T3-L1脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中，并且隨著細(xì)胞的分

19、化成熟，其表達(dá)水平之間增高，而且其表達(dá)增高的趨勢與細(xì)胞脂質(zhì)積聚過程呈現(xiàn)較好的一致性。由此現(xiàn)象推測，CACNA1F基因的功能與脂肪細(xì)胞的成熟及脂質(zhì)積聚有關(guān)，即該基因參與了脂肪細(xì)胞的分化過程。隨著脂肪前體細(xì)胞的分化進(jìn)程，CACNA1F基因的表達(dá)逐漸上調(diào)，細(xì)胞膜表面鈣離子通道的數(shù)量逐漸增加，其介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升，促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的分化以及脂質(zhì)積聚。進(jìn)一步的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CACNA1F基因在細(xì)胞分化的03天表達(dá)水平并無明顯變化。至35天時其表達(dá)水平才開始有顯著上升，這可能與03天時細(xì)胞尚處于克隆性增殖階段(DNA復(fù)制階段，將提供更多基因啟動位點以促進(jìn)細(xì)胞分化)有關(guān)11。第3天起，

20、CACNA1F基因的表達(dá)水平開始顯著上升，同時細(xì)胞的形態(tài)也由類似成纖維細(xì)胞的不規(guī)則型轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成逐漸增加，至810天，CACNA1F基因表達(dá)水平趨于平穩(wěn)，則可能與細(xì)胞已分化成熟、進(jìn)入終末分化階段有關(guān)。 【參考文獻(xiàn)】 1 Zemel MB，Miller SL.Dietary calcium and dairy modulation of adiposity and obesity risk.Nutr Rev，2004，62(4)：125-131. 2 Zemel MB.Nutritional and endocrine modulation of intracellular cal

21、cium：implications in obesity，insulin resistance and hypertention.Mol Cell Biochem，1998，188(1-2)：129-136. 3 龔海霞，郭錫熔，陳榮華，等.肥胖大鼠脂肪組織基因表達(dá)譜系研究.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2003，20(3)：268-271. 4 Ntambi JM，Kim YC.Adipocyte differentiation and gene expression.J Nutr，2000，130(12)：3122S-3126S. 5 Morgans CW，Gaughwin P，Maleszka R.Expession of the 1F calcium channel subunit by photoreceptors in the rat retina.Molecular Vision，2001，7：202-209. 6 曹立珍，譚煥然.L型鈣離子通道1亞單位的分子生物學(xué)研究進(jìn)展.中國藥理學(xué)通報，1998，14(6)：484-487. 7 Yamakage M，Namiki A.Cal