siRNA表達(dá)載體對宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡和增殖的影響

1、siRNA表達(dá)載體對宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡和增殖的影響 作者：李大可 ,彭芝蘭 ,周斌兵【摘要】 目的: 觀察HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體對宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡和增殖的影響。方法： 利用脂質(zhì)體將HPV16 E6特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞，通過熒光定量RTPCR檢測E6 mRNA的變化，流式細(xì)胞儀檢測E6蛋白和細(xì)胞凋亡率的變化，MTT法和細(xì)胞克隆法檢測細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果： HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體可明顯抑制Caski細(xì)胞E6 mRNA和E6蛋白的表達(dá)，抑制率分別為89.5和98.1；表達(dá)載體可明顯增加細(xì)胞凋亡率，抑制細(xì)胞的增殖和克隆的形成。結(jié)論： HP

2、V16 E6 siRNA表達(dá)載體可以特異高效地抑制宮頸癌Caski細(xì)胞E6基因的表達(dá)，增加細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和克隆的形成。 【關(guān)鍵詞】 siRNA表達(dá)載體； 宮頸癌； 細(xì)胞增殖； 凋亡 研究表明，人乳頭瘤病毒(HPV) 16型E6 基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及惡性表型的維持中起著至關(guān)重要的作用，因此它已成為宮頸癌基因治療的理想靶點之一。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種封閉基因表達(dá)的有效方法12 。已有研究證實，化學(xué)合成的小干擾RNA (siRNA) 能有效地抑制目的基因的表達(dá)，但作用持續(xù)時間短，而siRNA表達(dá)載體的方法可能延長作用持續(xù)時間3。本研究擬通過載體介導(dǎo)的RNAi

3、技術(shù)來封閉宮頸癌Caski細(xì)胞E6基因的表達(dá)，觀察HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體對Caski細(xì)胞增殖的影響。 1 材料和方法 1.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Caski細(xì)胞為HPV16陽性的宮頸癌細(xì)胞株，購自武漢大學(xué)典型物培養(yǎng)保藏中心。在研究中用脂質(zhì)體法將HPV16 E6特異性siRNA表達(dá)載體E62(由第一作者所在實驗室設(shè)計構(gòu)建保存)4和空載體P0轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞，通過G418(1 500 g·ml-1)抗性篩選，至空白對照細(xì)胞完全死亡后，降低G418為750 g·ml-1，轉(zhuǎn)染后14 d得到抗性克隆細(xì)胞，分別命名為Caski E62、Caski P0。收集抗性克隆形成后1周的

4、細(xì)胞。 1.2 熒光定量RTPCR檢測HPV16 E6 mRNA的表達(dá)1.2.1 細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 操作參照試劑盒TrizolTMRNA Isolation Reagent(GIBCO)和RevertA idTM First Strand cDNA synthesis Kit(MBI)說明書進(jìn)行。 1.2.2 熒光定量RTPCR擴增 實驗設(shè)Caski組（空白對照組）、Caski P0組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）、Caski E62組3組，每項檢測重復(fù)3次，取平均值。為避免收集細(xì)胞和實驗過程中RNA的降解、所收集細(xì)胞數(shù)量的差異以及實驗過程中操作帶來的誤差，計算時用細(xì)胞中表達(dá)恒定的看家基因GAPD

5、H(3磷酸甘油醛脫氫酶)逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物量的CT值來校正HPV16 E6 mRNA表達(dá)變化。HPV16 E6上游引物為5GAATGTGTGTACT GCAAGCA3，下游引物為5CACAGTGGCTTTTGACA GTT3，TAQman探針為5CAGCATATGGATTCCCATC TC3。GAPDH上游引物為5TGGGTGTGAACCACG AGAA3，下游引物為5 GGCATGGACTGTGGTCAT GA3，探針為5CTGCACCACCAACTGCTTAGC3。其中探針于5端標(biāo)記熒光發(fā)光基團FAM，3端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。在熒光定量PC

6、R儀上進(jìn)行PCR，擴增條件如下: 94 1 min；94 10 s，55 30 s，72 1 min，45個循環(huán)；55 30 s。從PCR動力學(xué)曲線讀取熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)CT值。 1.2.3 熒光定量RTPCR結(jié)果計算 參照文獻(xiàn)5報道的比較閾值法。從各樣品熒光定量PCR動力學(xué)曲線中判讀其Ct值，用處理組樣本基因的Ct值減去處理組參照基因的Ct值，得到Ct1，同樣，用對照組樣本基因的Ct值減去對照組參照基因的Ct值，得到Ct2，再用Ct1減去Ct2，得到Ct，即CtCt1-Ct2。處理組樣本基因相對于對照組樣本基因的量通過公式：處理組樣本基因/對照組樣本基因=EX-Ct 。

7、抑制率=（1-EX-Ct）×100。 1.3 流式細(xì)胞儀檢測HPV16 E6蛋白的表達(dá) 流式細(xì)胞儀由四川大學(xué)人類疾病生物治療實驗室提供。流式細(xì)胞術(shù)檢測陰性對照組、Caski組、Caski P0組、Caski E62組4組細(xì)胞中HPV16 E6蛋白的表達(dá)，每項檢測重復(fù)3次，取平均值。蛋白抑制率公式：1-（轉(zhuǎn)染后待測樣品的蛋白熒光強度-陰性對照）/（未轉(zhuǎn)染樣品的蛋白熒光強度-陰性對照）×100。 1.4 細(xì)胞凋亡測定 胰酶消化培養(yǎng)好的細(xì)胞，得到細(xì)胞沉淀，置于1 ml eppendorf管中，PBS緩沖液重懸細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min得到細(xì)胞沉淀。再

8、次重復(fù)洗滌沉淀過程，加入75%乙醇重懸細(xì)胞并固定30 min以上，送流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測。 1.5 生長曲線的測定 分別取對數(shù)生長期的Caski、Caski P0、Caski E62細(xì)胞,消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為105ml-1，以50 l·孔-1接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，放入37 、5% CO2 孵箱培養(yǎng)；于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d 后，每孔加入MTT溶液(5 mg·ml-1) 20 l，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 l DMSO

9、振蕩，并于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長下測定各孔光吸收(A)值。以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。 1.6 細(xì)胞克隆形成率的測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以每孔200個細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔設(shè)4個復(fù)孔，于37 、5CO2飽和濕度環(huán)境下靜止培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS(0.01 mmol，pH 7.4)洗滌2次，純甲醇固定15 min，姬姆薩染色20 min，流水洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)。將細(xì)胞數(shù)大于50個細(xì)胞團作為克隆計數(shù)，取平均克隆數(shù)計算克隆形成率。克隆形成率()=平均克隆數(shù)/每孔加入的單細(xì)胞數(shù)×100。 1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

10、 實驗結(jié)果以x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，多組的兩兩比較用SNK法。 2 結(jié) 果 2.1 HPV16 E6 mRNA表達(dá)的變化 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算擴增效率EX=1.8，即CT值減少1個循環(huán)對應(yīng)模板DNA增加1.8倍。由表1可見，Caski E62組細(xì)胞E6 mRNA表達(dá)較Caski組明顯降低(P0.05)，抑制率為92.15%。而Caski P0組細(xì)胞與Caski組相比，E6 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表1 HPV16 E6和內(nèi)對照GAPDH mRNA的 Ct值、Ct值及抑制率與Caski組比較，1）P0.05,2)P0.052.2 HPV16

11、E6 蛋白表達(dá)的變化 由表2可見，Caski細(xì)胞E6蛋白表達(dá)較Caski組降低(P0.05)，抑制率為98.1%。而Caski P0細(xì)胞與Caski組相比，E6蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.3 轉(zhuǎn)染RNA干擾表達(dá)載體后Caski細(xì)胞凋亡情況的變化 轉(zhuǎn)染 Caski E62、 Caski P0質(zhì)粒的陽性克隆株及Caski細(xì)胞的凋亡峰值見圖1。 Caski E62、Caski P0及Caski組細(xì)胞的凋亡率依次為27.1%、1.4及1.3，可見轉(zhuǎn)染RNAi表達(dá)質(zhì)粒表2 HPV16 E6蛋白熒光表達(dá)強度值及抑制率 的細(xì)胞凋亡率明顯高于Caski P0及Caski組。 2.4 MTT 法檢測細(xì)胞生

12、長曲線的變化 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒E62、空質(zhì)粒P0的Caski細(xì)胞陽性克隆及Caski細(xì)胞第15天的MTT A值及細(xì)胞生長曲線見表3和圖2。表3 各組細(xì)胞不同時間點的A值 可見轉(zhuǎn)染RNA干擾表達(dá)載體E62的細(xì)胞生長速度較Caski組細(xì)胞明顯減慢。而Caski P0組與轉(zhuǎn)染前相比，細(xì)胞增殖無明顯變化。Caski P0 和Caski 細(xì)胞的生長速率相近，而Caski E62細(xì)胞生長速度明顯減慢,表明E6 siRNA 表達(dá)載體E62的導(dǎo)入影響了Caski細(xì)胞的生長。 2.5 細(xì)胞克隆形成率 統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Caski E62組的克隆形成數(shù)與Caski組及Caski P0組比較差異有顯著性（P0.05），Cas

13、ki P0細(xì)胞的克隆形成數(shù)與Caski細(xì)胞比較差異無顯著性（P0.05）。見表4。表4 各組細(xì)胞的克隆計數(shù)及克隆形成率 與Caski組比較，1）P0.05,2)P0.05 3 討 論 siRNA目前主要是通過體外直接化學(xué)合成，但化學(xué)合成的siRNA引起的基因沉默效應(yīng)存在著作用時間短（一般不超過1周）而且耗費大等缺點。本研究使用的pSilencer 3.0H1載體含H1啟動子，可在絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)自主合成小分子RNA，被廣泛應(yīng)用于反義RNA技術(shù)。載體包含有RNA聚合酶(Pol)啟動子(Hl prom)和1個有5個T的轉(zhuǎn)錄終止位點，1個保守的A開始轉(zhuǎn)錄合成RNA。遇到5個連續(xù)的U即終止，轉(zhuǎn)錄

14、產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄終止位點的第2個堿基處終止，非常精確。只要將編碼一小段對應(yīng)目的基因特異序列的、其RNA能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA序列插入載體中Pol 啟動子的下游，轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞，載體就能表達(dá)出短發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)，這種RNA很快在細(xì)胞中加工成為大約21個堿基大小的雙鏈RNA分子，隨后啟始RNA干擾過程6 。該質(zhì)粒帶有可表達(dá)抗氨基糖苷類抗生素G418蛋白氨基糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的Neo基因，通過G418篩選,得到能長時間穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾狀RNA的陽性克隆細(xì)胞。 本研究利用前期構(gòu)建成功的HPV16 E6特異性siRNA表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞，觀察它對E6基因的抑制作

15、用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在抗性克隆形成后1周，即轉(zhuǎn)染后3周，E6 siRNA表達(dá)載體能使Caski 細(xì)胞E6 mRNA和蛋白的表達(dá)被明顯抑制，抑制率分別為89.5和98.1，而空載體對二者的表達(dá)皆無明顯影響，說明HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體能特異高效地抑制Caski細(xì)胞E6基因的表達(dá)；而且siRNA表達(dá)載體的作用持續(xù)時間明顯超過了化學(xué)合成siRNA的作用時間，說明HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體能較長期地抑制Caski細(xì)胞E6基因的表達(dá)。 轉(zhuǎn)染E62、P0質(zhì)粒的陽性克隆及Caski組細(xì)胞的凋亡率分別為27.1%、1.4、1.3，可見我們構(gòu)建的HPV16 E6 RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后明顯增

16、加了細(xì)胞的凋亡率，而空質(zhì)粒P0組的凋亡率并未增加，排除了質(zhì)粒本身及G418篩選可能造成的影響，說明質(zhì)粒是通過抑制E6基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。 E6蛋白致癌的關(guān)鍵是由于它與p53結(jié)合,導(dǎo)致p53降解,從而使p53對細(xì)胞增殖周期相關(guān)因子 p21(WAF1)、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）等的調(diào)節(jié)作用喪失，細(xì)胞中DNA損傷累積造成細(xì)胞癌變。抑制E6的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞的p53反應(yīng)蛋白表達(dá)上調(diào)，激活caspase9和caspase3，抑制細(xì)胞的增殖78。細(xì)胞生長曲線顯示，E62表達(dá)載體明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的生長，Caski E62細(xì)胞在軟瓊脂上形成克隆能力也明顯低于Caski P0和Caski細(xì)胞，提示我們

17、構(gòu)建的RNA干擾表達(dá)載體明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增生和克隆的形成。而空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的Caski P0組細(xì)胞生長速率和克隆形成率與Caski組細(xì)胞比較無明顯變化，排除了質(zhì)粒本身及G418對細(xì)胞的影響。 綜上所述，HPV16 E6 siRNA表達(dá)載體可以特異高效地抑制宮頸癌Caski細(xì)胞E6基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這為HPV相關(guān)宮頸癌的基因治療提供了理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1EFFNER M,WERNESS B A,HUIBREGTSE J M,et al.The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types

18、16 and 18 promotes the degradation of p53J.Cell,1990，63(6):11291136.2BAK D.RNAiRNA interferencean efficient way for silenceJ.J Postepy Biochem,2003,49(3):136146.3CAPLEN N J,PARRISH S,IMANI F,et al.Specific inhibition of gene expression by small doublestranded RNAs in invertebrates and vertebrate systemsJ.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:97469747.4李大可,彭芝蘭,牛曉宇,等.RNAi表達(dá)載體對宮頸癌HPV16 E6基因表達(dá)的抑制作用J.四川大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2005,36(