大鼠β細(xì)胞素基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)

1、大鼠細(xì)胞素基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá) 作者：安家澤，宋振順，竇科峰，李開宗，韓驊 【關(guān)鍵詞】 基因克隆 【Abstract】 AIM: To obtain large amount of rat betacellulin so as to explore the function of the protein and prepare the antibody against this protein. METHODS: A 544 bp of rat betacellulin gene fragment was amplified by PCR method from rat kidne

2、y and cloned into pET28a（+）vector, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pET28arBTC. The plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced to express betacellulin with IPTG. The expression of betacellulin was detected by SDSPAGE electrophoresis and Western blot. RE

3、SULTS: A novel protein with expected molecular weight was expressed upon induction with IPTG. The expressed product showed good reactivity to antiHis tag antibody, and was most in inclusion body sections. CONCLUSION: Cloning and expression of betacellulin gene lay a basis for the further study on th

4、e function of this protein and pancreatic stem cell differentiation. 【Keywords】 Betacellulin; gene clone; gene expression, pET vector 【摘要】 目的: 獲得大量重組大鼠細(xì)胞素(BTC)，為研究細(xì)胞素的功能及制備其抗體奠定基礎(chǔ). 方法: 利用PCR方法從大鼠腎組織擴(kuò)增出544 bp的細(xì)胞素基因片段并按讀框克隆到原核表達(dá)載體pET28a（+）上，得到重組質(zhì)粒pET28arBTC,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞素蛋白表達(dá)，SDSPAGE 和Wes

5、tern blot檢測. 結(jié)果: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，有明顯的目的蛋白表達(dá)，分子量符合細(xì)胞素；表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在；表達(dá)量約占菌體蛋白總量的20%30%；目的蛋白與抗His標(biāo)簽抗體具有良好的反應(yīng)原性. 結(jié)論: 大鼠細(xì)胞素基因的克隆與表達(dá)為進(jìn)一步開展細(xì)胞素蛋白功能和胰腺干細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞素；基因克隆; 基因表達(dá)；pET載體 0引言 細(xì)胞素(betacellulin, BTC)是表皮細(xì)胞生長因子家族成員之一，在多器官系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中起重要作用，尤其高表達(dá)于胰腺組織中，提示細(xì)胞素可能在胰腺發(fā)育和胰腺干細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用. 我們利用基因工程技術(shù)克隆了細(xì)胞素基因

6、，并利用pET原核系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)，為進(jìn)一步開展細(xì)胞素蛋白功能和胰腺干細(xì)胞分化的研究奠定了基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 T載體PMD18T (Takara公司); pET28a（+）(Novagen產(chǎn)品); 大腸桿菌BL21及XL10(第四軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室提供); 限制性內(nèi)切酶、Solution I，標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，蛋白質(zhì)Marker，PCR試劑盒，IPTG等(Takara公司); 質(zhì)粒純化、DNA回收試劑盒(華舜公司); Hybond ECL硝酸纖維膜(Pharmacia公司產(chǎn)品); ECL發(fā)光試劑(PIERCE公司). 1.2方法 1.2.1細(xì)胞素基因的擴(kuò)增及序列

7、測定引物設(shè)計合成：根據(jù)GenBank中大鼠細(xì)胞素基因序列，設(shè)計引物，上游引物序列為：5ACACAGCACGGTTGATGG3(18 bp)，下游引物：5CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3(20 bp)，其中上、下游引物的5端分別引入EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn). 目的基因的擴(kuò)增及序列測定：應(yīng)用PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因，總反應(yīng)體積為50 L，循環(huán)參數(shù)為：95 4 min; 95 30 s, 55 30 s, 72 1 min，35個循環(huán)，再于72延伸7 min. 目的基因的序列測定：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體pMD18T中, 構(gòu)建pMD18TrBTC，酶切鑒定正確后，交由上海生工公司

8、進(jìn)行DNA序列測定. 1.2.2細(xì)胞素原核表達(dá)載體的構(gòu)建以EcoR I和Sal I雙酶切經(jīng)測序正確的PMD18TrBTC，獲取細(xì)胞素基因. 以EcoR I和Sal I雙酶切pET28a（+）載體，分別回收細(xì)胞素基因和pET28a（+）載體片段，Solution I連接上述基因和載體片段，構(gòu)建細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28（a+）rBTC，轉(zhuǎn)化E.coli XL10感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定. 1.2.3細(xì)胞素的原核表達(dá)及檢測以細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28（a+）rBTC轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取用含卡那霉素的LB平板篩選的陽性克隆于LB

9、培養(yǎng)基中，37振搖過夜，按1100轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基2 mL中，37振搖約3 h，使A600 nm約0.6（0.41.0），加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)3 h. 于4離心15 000 g×1 min，收集菌體并裂解，4離心15 000 g×10 min，分別取上清及沉淀（包涵體），進(jìn)行SDSPAGE 和Western blot檢測. 2結(jié)果 2.1細(xì)胞素基因的擴(kuò)增、克隆及序列測定細(xì)胞素基因的PCR產(chǎn)物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見544 bp特異性條帶（Fig 1），回收片段后插入pMD18T，形成pMD18TrBTC，酶切鑒定得到正確克隆，以M13+

10、/M13-為引物進(jìn)行序列測定. 測序結(jié)果與GenBank中大鼠細(xì)胞素基因序列比對無突變. 2.2大鼠細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28arBTC構(gòu)建用EcoR I和Sal I雙酶切pMD18TrBTC，回收片段后與經(jīng)過相同酶切的pET28a（+）片斷連接，轉(zhuǎn)化E.coli XL10感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，挑單克隆擴(kuò)增小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定. EcoR I和Sal I雙酶切得到的片段，與預(yù)期的大小一致. 2.3pET28arBTC的原核表達(dá)及鑒定將原核表達(dá)載體pET28arBTC轉(zhuǎn)化到E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可見Mr為20 000的融合蛋白，主要以

11、包涵體形式表達(dá). 以antiHis一抗做Western blot，可檢測到表達(dá)的融合蛋白（Fig 2,3）. 3討論 干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響. 在干細(xì)胞的分化過程中，細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用. 細(xì)胞素可能參與了胰腺的發(fā)育和胰腺干細(xì)胞的分化等過程1. 細(xì)胞素不僅具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)各種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，而且能夠?qū)⒁认俜置诘矸勖傅募?xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素分泌細(xì)胞2,3. 有研究表明，將大鼠胰腺切除90%后，立即給大鼠尾靜脈注射細(xì)胞素（0.5 g/g），10 d后大鼠糖尿病狀態(tài)有所緩解，細(xì)胞素治療組大鼠血糖水平顯著低于對照組，而血漿胰島素水平顯著高于非治療組，持續(xù)時間長達(dá)4

12、 wk，治療30 d后病理學(xué)檢查證實(shí)細(xì)胞素組大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)較對照組的大，胰島樣細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目明顯增多，糖耐量試驗(yàn)表明細(xì)胞素治療的大鼠對糖刺激有很好的反應(yīng)性4；用鏈脲霉素制成的糖尿病小鼠注射細(xì)胞素后，也取得了同樣的效果5，由此可以推斷，細(xì)胞素可能促進(jìn)了細(xì)胞的增殖或者是促進(jìn)了胰腺干細(xì)胞增殖分化為細(xì)胞，分泌胰島素達(dá)到降低血糖的作用. 細(xì)胞素的多重生物學(xué)作用日益引起人們的重視，它作為信號分子在組織器官的發(fā)育、干細(xì)胞的增殖與分化以及在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用都有待研究，我們完成了大鼠細(xì)胞素的基因克隆并成功地構(gòu)建細(xì)胞素的原核表達(dá)載體，通過Western blot證實(shí)能夠在大腸桿菌中表達(dá). 為進(jìn)一步研究其功能以

13、及在胰腺干細(xì)胞分化中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ). 【參考文獻(xiàn)】 1 Dunbar AJ, Goddard C. Structurefunction and biological role of betacellulinJ. Int J Biochem Cell Biol, 2000;32(8):805-815. 2 Li L, Yi Z, Seno M, et al. Activin A and betacellulin: Effect on regeneration of pancreatic betacells in neonatal streptozotocintreated ratsJ. D

14、iabetes, 2004;53(3):608-615. 3 Yamamoto T, Akisue T, Marui T, et al. Expression of betacellulin, heparinbinding epidermal growth factor and epiregulin in human malignant fibrous histiocytomaJ. Anticancer Res, 2004;24(3b):2007-2010. 4 Li L, Seno M, Yamada H, et al. Promotion of betacell regeneration by betacellulin in ninety percentpancreatectomized ratsJ. Endocrinology, 2001;142(12):5379-5385. 5 Li L, S